碳酸酐酶的固定化及其CO2的捕集性能

摘要

CO2是温室气体的主要组成成分，是造成全球变暖的主要因素，其高效捕集以及资源化利用已成为亟待广大研究工作者解决的一大难题。生物酶法固定化CO2由于其绿色环保、高效、高度专一的催化性能以及反应条件温和的特点而受到研究者们的关注。但游离酶的稳定性差，对有机溶剂、高温或极端pH环境敏感，难以回收利用成为阻碍其应用的主要问题。而酶的固定技术，可以使酶像固体催化剂一样回收再利用，同时保持酶原有的特性，为酶的应用提供了有效的途径。目前固定化酶已经应用于工业生产、医药、化学分析及环境工程等众多领域。
　　碳酸酐酶(CA)是一种以Zn2+为活性中心的金属酶，可以加速可逆CO2的水合反应速率，使其转化为HCO3-离子。CO2带来的温室效应对生态平衡已经造成了严重的危险，利用固定化CA用于CO2高效捕集在酶工程和环境保护领域均是很重要的研究课题。研究制备可高效地固定CA的载体，并将固定化CA应用于矿化法固定CO2或用于有机胺溶液捕集CO2，在减少温室气体排放，保护人类生存环境方面是很重要的技术。
　　首先，采用后改性法，将3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)接枝在SBA-15表面，制得了氨基功能化介孔材料(AFS)，进行相应的表征后，使用共价结合法将CA固定于AFS上，探讨了CA与载体AFS间的作用机理，并研究了最适的固定化条件。研究结果表明，CA的等电点为6.4，当介质的pH为7.0时，CA表面带负电荷，可与带正电荷的载体GFS之间产生静电相互作用，有助于CA在AFS上的固定化，在AFS用量为10mg/10mL of CA，固定化时间为2h的条件下，CA的固载量为63.2mg/g of AFS，有63％的CA完成了固定化。对此条件下所制得的固定化CA(CA/AFS)的酶学性质进行了研究。结果表明，在40℃时CA/AFS的活性最强，比游离CA提高5℃，在40-55℃范围内都保持有较高的活性;CA/AFS的最适反应pH为10.0，比游离CA（最适反应pH为8.5）有所提高，且具有较好的pH稳定性;在4℃下保存30天，CA/AFS仍保留初始活性的83％，游离CA仅保存了30％的活性;循环使用20次后，CA/AFS仍具有78％的初始活性，表明其具有较好的重复利用性;CA/AFS在5wt％的MDEA溶液中热稳定性较好，在温度低于50℃时可以保持80％以上的活性，当温度升高到90℃后，CA/AFS保持了初始活性的11％，而游离CA在35℃时就仅保存了8％的活性，温度超过60℃后，几乎检测不到游离CA的活性。游离CA和CA/AFS的米氏常数Km值分别为2.4mM和3.0mM，表明固定化后，CA与底物间的亲和力变弱，这是因为固定化后底物与酶的活性中心接触变困难，与多数固定化酶的情况相同;游离CA和CA/AFS的kcat/Km值分别为896.4M-1·s-1和728.2M-1·s-1，表明经固定化后，CA的活性有所下降。
　　接着，利用γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)对SBA-15进行改性，制得环氧功能化介孔材料(GFS)，进行相应的表征后，利用共价偶联法将CA固定于GFS上，探讨了CA与载体GFS的作用机理，并研究了最适固定化条件。结果表明，当介质的pH为6.0时，小于CA的等电点，CA分子荷正电，载体GFS此时的zeta电位为负值，CA分子与载体GFS间会产生很强的静电相互作用，有助于CA的固定化，在GFS用量为5mg/10mL of CA，固定化时间为2h条件下，CA的固载量为72.6mg/gof GFS，约有36％的CA被固定化于GFS上。对此条件下所制得的固定化CA(CA/GFS)的酶学性质进行了研究。结果表明，在40℃时CA/GFS的活性最强，比游离CA提高5℃，在40-55℃范围内的活性略高于CA/AFS;CA/GFS的最适反应pH为10.0，比游离CA有所提高，且具有较好的pH稳定性;在4℃下保存30天，CA/GFS仍保留初始活性的91％;循环使用20次后，CA/GFS仍具有87％的初始活性，表明其具有较好的重复利用性;CA/GFS在5wt％的MDEA溶液中热稳定性较好，在温度低于50℃时可以保持80％以上的活性，当温度升高到90℃后，CA/AFS保持了初始活性的13％。CA/GFS的米氏常数Km值为3.1mM，高于游离CA，表明固定化后，CA与底物间的亲和力变弱;CA/GFS的kcat/Km值为757.4M-1·s-1，说明CA经固定化后活性有所下降。
　　考虑到以上两种载体的成本较高，又对已商品化的氨基功能化树脂（以交联聚丙烯酸酯为骨架基质的氨基功能化树脂，LX-1000EA，简称EA）做为固定化载体进行了相应考察。CA与载体EA的作用机理与AFS类似。研究最适固定化条件的结果表明，在EA用量为200mg/10mL of CA，固定化时间为2h条件下，CA的固载量为9.1mg/g of EA，约有99％的CA被固定化于EA上。对此条件下所制得的固定化CA（CA/EA）的酶学性质进行了研究。结果表明，在35℃时CA/GFS的活性最强，在15-55℃范围内的活性均高于游离CA，但比CA/AFS和CA/GFS活性低;CA/EA的最适反应pH为9.0，比游离CA有所提高，且具有较好的pH稳定性;在4℃下保存30天，CA/EA仍保留初始活性的90％;循环使用10次后，CA/EA仍具有83％的初始活性，表明其具有较好的重复利用性;在5wt％的MDEA溶液中，温度为35℃时CA/EA的活性最强，保持了初始酶活的62％，之后随着温度升高，CA/EA活性呈下降趋势，当温度升高到90℃后，CA/EA保持了初始活性的8％。CA/EA的米氏常数Km值为8.8mM，高于游离CA、CA/AFS和CA/GFS，表明CA/EA对底物的亲和力比CA/AFS和CA/GFS都弱;CA/EA的kcat/Km值为672.1M-1·s-1，说明CA/EA的催化活性要低于CA/AFS和CA/GFS。
　　最后，研究了固定化CA分别用于CO2的矿化吸收及叔胺液(MDEA)吸收-解吸过程的效果。当固定化CA用于CO2的矿化吸收过程时，由于游离CA的活性位点更易接触，且其活性高于固定化CA，因此游离CA催化生成CaCO3的量最多，生成CaCO3量的顺序为:游离CA(247mg)＞CA/GFS(231mg)＞CA/AFS(209mg)＞CA/EA(202mg)。当用MDEA溶液吸收CO2时，MDEA，CA+MDEA，载体+MDEA以及固定化CA+MDEA四种溶液吸收CO2的反应速率快慢分别为:CA+MDEA＞CA/AFS+MDEA＞MDEA＞AFS+MDEA;CA+MDEA＞CA/GFS+MDEA＞MDEA＞GFS+MDEA;CA+MDEA＞CA/EA+MDEA＞EA+MDEA＞MDEA,可见固定化CA的加入对MDEA溶液吸收CO2有明显的促进作用;MDEA溶液解吸CO2的实验结果表明，固定化CA和相应载体的加入对CO2平衡解吸量基本没有影响，CA/AFS、CA/GFS、载体AFS和载体GFS的加入可以在未达到平衡状态之前，提高CO2的瞬时解吸量。由于游离CA结构在高温条件下会发生团聚失活，导致游离CA的添加对CO2解吸速率无影响。载体均为多孔材料，它们的加入能提高解吸过程的传热和传质过程，进而提高CO2解吸速率，但载体中固定化的CA对解吸速率无影响。

目录

声明

摘要

图目录

表目录

主要符号表

1 绪论

1．1二氧化碳捕集技术的研究进展

1．2酶固定化技术的研究进展

1．2．1酶的固定化方法概述

1．2．2固定化酶的制备原则

1．2．3固定化酶的形态与特性

1．2．4固定化酶载体的研究进展

1．2．5固定化酶的应用概况

1．3 碳酸酐酶的研究进展

1．3．1碳酸酐酶的发展史

1．3．2碳酸酐酶的分类

1．3．3碳酸酐酶的结构特点

1．3．4碳酸酐酶的催化机理

1．3．5碳酸酐酶的抑制剂

1．3．6碳酸酐酶的固定化研究进展

1．4生物酶催化法捕集二氧化碳

1．5本课题的研究目的与内容

2．1 实验药品

2．2实验所用设备

2．3样品合成方法

2．4样品表征

2．4．1 X射线衍射

2．4．2氮气物理吸附

2．4．3傅立叶红外光谱

2．4．4扫描电镜

2．4．5 固体超导核磁共振波谱仪

2．5固定化酶的评价

2．5．1 碳酸酐酶浓度的检测

2．5．2 CA固载量的计算

2．5．3酶活性的测定

2．5．4米氏常数及相关动力学系数的测定

2．5．5气液平衡装置

2．5．6气体解吸装置

3 氨基功能化SBA-15载体的制备及其固定化酶的研究

3．1 引言

3．2氨基功能化载体的合成及固定化碳酸酐酶的制备

3．2．1氨基功能化载体的合成

3．2．2 CA的固定化

3．2．3最佳固定化条件的确定

3．3游离CA及CA／AFS的动力学研究

3．3．1测定温度对游离CA及CA／AFS活性的影响

3．3．3测定游离CA及CA／AFS的贮存稳定性

3．3．4测定CA／AFS的重复利用性

4．3．5测定游离CA与CA／AFS在MDEA溶液中的热稳定性

3．4结果与讨论

3．4．1氨基功能化材料AFS的表征

3．4．2最佳固定化条件的确定

3．4．3游离CA及CA／AFS的动力学研究

3．5 本章小结

4环氧功能化SBA-15载体的制备及其固定化酶的研究

4．1 引言

4．2氨基功能化载体的合成及固定化碳酸酐酶的制备

4．2．1环氧功能化载体的合成

4．2．2 CA的固定化

4．2．3最佳固定化条件的确定

4．3．1 测定温度对游离CA及CA／GFS活性的影响

4．3．2测定pH值对游离CA及CA／GFS活性的影晌

4．3．3 测定游离CA及CA／GFS的贮存稳定性

4．4．1环氧功能化材料GFS的表征

4．4．2最佳固定化条件的确定

4．4．3游离CA及CA／GFS的动力学研究

4．5 本章小结

5 氨基功能化树脂用于CA固定化及相关性质的研究

5．1 引言

5．2氨基功能化树脂固定化碳酸酐酶

5．2．1氨基功能化树脂的预处理

5．2．2 CA的固定化

5．2．3最佳固定化条件的确定

5．3游离CA及CA／EA的动力学研究

5．3．1测定温度对游离CA及CA／EA活性的影响

5．3．2测定pH值对游离CA及CA／EA活性的影响

5．3．4测定CA／EA的重复利用性

5．3．5测定游离CA与CA／EA在MDEA溶液中的热稳定性

5．4结果与讨论

5．4．1 最佳固定化条件的确定

5．4．2游离CA及CA／EA的动力学研究

5．5本章小结

6 固定化CA用于CO2吸收的研究

6．1 引言

6．2 固定化CA用于CO2的矿化反应及叔胺溶液MDEA吸收CO2的反应

6．3．1 固定化CA用于CO2的矿化反应

6．3．2固定化CA用于MDEA溶液吸收CO2的反应

6．3．3固定化CA用于MDEA溶液解吸CO2的反应

6．4本章小结

7结论与展望

7．1 结论

7．2创新点

7．3 展望

参考文献

附录

攻读博士学位期间科研项目及科研成果

致谢

作者简介