类hEGF短肽P-WH在皮肤抗衰老中的功能与机制

摘要

皮肤衰老是衰老最为显著的外在体现，通常皮肤整体会逐渐开始出现干燥，皱纹，色素不均形成老年斑、雀斑或肝斑（太阳斑），伤口愈合延迟等老化结果。皮肤衰老是由内源性变化和外源性损伤共同引起的自然过程。皮肤出现衰老特征主要是由于紫外线引起皮肤细胞内ROS响应，激活下游相关通路，从而影响Ⅰ型胶原蛋白（collagenⅠ，Col-1）及基质金属蛋白酶Ⅰ（matrix metalloproteinasesⅠ，MMP-1）的表达，使得Col-1流失，造成皮肤出现皱纹等老化特征。人类表皮生长因子（human epidermal growth factor，hEGF）是当前应用于临床皮肤修复、再生及抗衰老领域的重要活性成分。但由于较大的分子量与复杂的结构导致的低透皮生物利用度及高昂的生产成本极大限制了其医学及商业应用。 本论文旨在设计得到一种类hEGF功能短肽，综合提高抗衰修复活性的同时，尽量使其分子量小、易吸收、易合成、降低成本。因此，以本实验室前期建立的抗氧化肽库中对比选取其中四条序列为参考模板，通过分子设计与优化，得到了共九种改造体。随后，分别在in vitro和in vivo水平对九种改造体进行一系列生物学模型筛选，其中包括抗氧化能力检测、细胞毒性测定、对Col-1转录激活能力的检测，以及动物皮肤修复模型验证，一致证明P-WH为兼顾强抗氧化能力、低毒性且促进胶原转录、具有皮肤修复功能的最优改造体；通过两种动物褶皱模型，证明100μg/mL P-WH不仅可以抑制褶皱生成，且具有修复并逆转已明显存在的褶皱的效果，且通过皮肤弹性测试和皮肤厚度测量实验验证，均得到一致结果。进一步对P-WH的皮肤修复机制研究揭示，P-WH可显著降低人皮肤成纤维细胞内ROS含量，上调I型胶原蛋白Col-1表达量的同时，降低其水解酶MMP-1表达量，涉及多重分子机制；最后对于P-WH进行安全性与稳定性评价，证明P-WH具有低毒、低溶血、无致敏活性且稳定性佳的优秀开发前景。

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摘 要

Abstract

引 言

1 文献综述

1.1 皮肤衰老概述

1.1.1 皮肤基本结构

1.1.2 紫外线与光老化

1.2 皮肤光老化及相关分子机制

1.2.1 胶原蛋白与水解酶

1.2.2 皮肤衰老分子靶标及相关信号通路

1.3 衰老皮肤修复

1.3.1 常见衰老皮肤修复成分

1.3.2 活性肽在衰老皮肤修复领域的研究进展

1.4 研究意义

2 类hEGF短肽的分子设计与生物学模型筛选

2.1 引言

2.2 材料与仪器

2.3 实验方法

2.3.1 类hEGF短肽改造体的优化设计

2.3.2 类hEGF短肽改造体抗氧化性能检测

2.3.3 类hEGF短肽改造体细胞毒性检测

2.3.6 数据处理分析

2.4 实验结果与讨论

2.4.1 类hEGF短肽改造体的设计结果及理化参数

2.4.2 类hEGF短肽改造体抗氧化活性分析

2.4.3 类hEGF短肽改造体细胞毒性分析

2.4.4 类hEGF短肽改造体报告基因结果分析

2.4.5 类hEGF短肽改造体对受损皮肤模型影响

2.5 本章小结

3 类hEGF短肽P-WH修复皮肤衰老的功能研究

3.1 引言

3.2 材料与仪器

3.3 实验方法

3.3.1 两种衰老皮肤模型构建

3.3.2 皮肤宏观评价

3.3.3 皮肤弹性测试

3.3.4 皮肤厚度测量

3.3.5 实验数据分析

3.4 实验结果分析

3.4.1 P-WH预防小鼠皮肤衰老

3.4.2 P-WH修复小鼠衰老皮肤

3.5 本章小结

4 In vivo类hEGF短肽P-WH修复皮肤衰老的机制研究

4.1 引言

4.2 材料与仪器

4.3 实验方法

4.3.1 细胞培养

4.3.2 细胞修复活性检测

4.3.3 细胞衰老模型构建

4.3.4 细胞内ROS水平检测

4.3.5 Western blotting检测Col I、MMP-1蛋白表达

4.3.6 数据分析处理

4.4 实验结果分析

4.4.1 P-WH对HFF-1细胞迁移的影响

4.4.2 细胞衰老模型验证

4.4.3 P-WH对细胞衰老模型ROS水平的影响

4.4.4 P-WH 修复皮肤衰老相关信号通路初探

4.5 本章小结

5 类hEGF短肽P-WH安全性与稳定性评价

5.1 引言

5.2 材料与仪器

5.3 实验方法

5.3.3 肥大细胞脱颗粒

5.3.4 血清稳定性

5.3.5 数据分析处理

5.4 实验结果分析

5.4.1 P-WH对皮肤细胞毒性与对红细胞溶血活性

5.4.2 P-WH对肥大细胞脱颗粒的影响

5.4.3 P-WH的血清稳定性

5.5 本章小结

结 论

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致 谢

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