含铜金属支架材料的性能及促内皮化作用研究

摘要

随着冠心病发病率的逐年升高，每年有越来越多的患者通过植入冠脉支架来缓解病情。尽管冠脉支架只经历了几十年的发展时间，却取得了令人瞩目的成效。然而，不管是最初的球囊成形术，还是后来的金属裸支架以及药物洗脱支架，都摆脱不了支架内再狭窄和血栓这两个难题。此外，虽然支架感染发病率很低，但死亡率却极高，该问题也应当值得人们关注。近些年来，有多方面研究证实Cu元素具有抗菌和促进血管生成的作用。临床上最常用的金属支架材料——316L不锈钢和L605钴基合金均是惰性材料，无法主动对人体起到有益的作用。因此，本文以上面两种材料为基础，制备了含铜316L(316L-Cu)不锈钢及含铜L605(L605-Cu)钴基合金支架材料，期望其在满足生物安全性和使用要求的前提下，通过微量和持续释放Cu离子，实现加速内皮化的作用，进而降低支架内再狭窄和血栓的发生率，同时也能有效预防感染。
　　本文设计了4种Cu含量（2，3，4，5wt.％）以及两种热处理工艺（固溶、固溶+时效）的316L-Cu不锈钢，通过金相、XRD、DSC、硬度、拉伸等实验方法，首先研究了材料的显微组织、富铜相析出和力学性能。其次，利用动电位极化、恒电位极化、阻抗谱和XPS等实验方法，深入研究了Cu含量对时效态316L-Cu不锈钢腐蚀性能的影响及相关机制。在体外实验中，利用CCK-8、细胞凋亡、Cu/Zn-SOD检测、免疫荧光、划痕、Transwell、小管生成、ELISA、动态凝血等实验方法，研究不同Cu含量及热处理工艺的316L-Cu不锈钢的促进内皮化作用和血液相容性。最后，通过一系列抗菌实验验证316L-Cu不锈钢的杀菌作用。基于以上实验结果，本文优化出综合性能最佳的316L-Cu不锈钢，再将其制备成支架后植入动物体内，研究其在体内是否也具有加速内皮化的作用。
　　本文还通过一系列方法研究了L605-Cu合金对内皮细胞增殖、凋亡、迁移、小管生成、成血管关键因子表达和血液凝固的影响，同时也研究了它的抗菌性能，验证了含Cu金属支架材料中Cu离子的溶出作用。
　　本文得到的主要结论如下:
　　(1)在固溶状态下，与316L相比，316L-Cu不锈钢的晶粒尺寸增大，其中316L-4/5Cu不锈钢经过时效处理后的晶粒会进一步长大。Cu的添加导致316L不锈钢的硬度、抗拉强度及延伸率下降，但对其屈服强度的影响不大（除316L-5Cu外）。经过时效处理后，316L-Cu不锈钢的硬度和抗拉强度均会回升，延伸率及屈服强度基本维持不变。除了316L-2Cu外，其余316L-Cu不锈钢在经过时效处理后均有富铜相出现，且富铜相的析出激活能随着Cu含量的增加而降低。
　　(2)在时效状态下，316L-2Cu不锈钢的点蚀电位略微下降，亚稳态点蚀比较容易萌发、长大，且再钝化时间变长。当Cu含量为3％时，不锈钢的点蚀电位上升，亚稳态点蚀不易萌发。当Cu含量为4％和5％时，不锈钢的点蚀电位再次下降，亚稳态点蚀更容易萌发和转化为稳态点蚀，表层钝化膜的Cr3+/Cr0会降低。因此，仅316L-3Cu不锈钢的耐点蚀能力有所增加。
　　(3)316L-Cu不锈钢无细胞毒性，并且能抑制内皮细胞的凋亡。固溶态316L-3Cu和固溶/时效态316L-4/5Cu不锈钢能增加内皮细胞中Cu/Zn-SOD的分泌，时效态316L-3Cu以及固溶/时效态316L-5Cu不锈钢的浸提液能明显加速内皮细胞的迁移运动。此外，几乎所有316L-Cu不锈钢均能加速小管生成实验中网络状结构的生成。固溶态316L-3Cu及固溶/时效态316L-4/5Cu不锈钢能明显促进与血管生成相关的eNOS的mRNA表达，其中时效态316L-4/5Cu还能明显增加另一相关基因VEGF的mRNA表达。同时，316L-Cu和316L不锈钢的血液相容性相当。此外，316L-Cu不锈钢能杀死其表面黏附的细菌，抑制细菌生物膜的形成，其杀菌率随着Cu含量的增加而升高，但基本不受热处理工艺的影响。
　　(4)通过对力学性能、耐腐蚀性能、体外促进内皮化作用和抗菌性能的整体比较，最终确定时效态316L-4Cu不锈钢具有最佳的综合性能。将其加工成冠脉支架，和316L裸支架、药物洗脱支架同时植入到动物体内。结果表明，含铜不锈钢支架在保证生物安全性的前提下能促进血管内皮化的程度，并且没有明显的炎症反应。
　　(5)与L605相比，L605-Cu合金能抑制内皮细胞的凋亡，其表面更适合内皮细胞的铺展和生长。它的浸提液也能明显增加内皮细胞的迁移能力和小管生成能力。此外，L605-Cu合金能明显增加内皮细胞中VEGF的mRNA相对表达量，并且具有更优异的血液相容性。在离子溶出满足生物安全性要求的前提下，该种含Cu钴基合金能够杀死其表面上的细菌，抑制细菌生物膜的形成。

目录

声明

摘要

主要符号表

1 绪论

1．1 医用金属材料及应用

1．1．1 医用不锈钢

1．1．2 医用钴基合金

1．1．3 医用钛及钛合金

1．2 冠脉支架的发展历程及临床难题

1．2．1 发展历程

1．2．2 临床难题

1．3 含Cu医用金属材料的研究现状

1．3．1 Cu的有益生物学作用

1．3．2 含铜医用不锈钢的研究现状

1．3．3 含铜医用钴基合金的研究现状

1．4 本文的研究目的和主要内容

2 实验材料及实验方法

2．1 材料制备

2．2 材料基本性能分析

2．2．1 金相观察

2．2．2 X射线衍射分析

2．2．3 差式扫描量热法

2．2．4 硬度测试

2．2．5 拉伸实验

2．3 材料耐腐蚀性能分析

2．3．1 动电位极化实验

2．3．2 恒电位极化实验

2．3．3 阻抗谱实验

2．4．1 细胞培养

2．4．2 浸提液制备

2．4．3 细胞增殖实验

2．4．4 细胞凋亡

2．4．5 Cu／Zn-SOD检测

2．4．6 免疫荧光

2．4．7 划痕实验

2．4．8 Transwell迁移实验

2．4．9 小管生成实验

2．4．10 RT-qPCR实验

2．4．11 上清液NO含量测定

2．4．12 上清液VEGF含量测定

2．4．13 动态凝血实验

2．4．14 体外实验数据分析

2．5 材料抗菌性能测试

2．5．1 抗菌实验

2．5．2 细菌生物膜观察

2．5．3 细菌活死染色

2．5．4 离子溶出测试

2．6 体内促进内皮化作用研究

2．6．1 支架制备及表征

2．6．2 支架植入手术过程

2．6．3 定量冠状动脉造影

2．6．4 光学相干断层成像术

2．6．5 SEM观察

2．6．6 苏木精-伊红染色

2．6．7 体内实验数据分析

3 316L-Cu不锈钢的组织、力学及腐蚀性能研究

3．1 引言

3．2．1 显微组织

3．2．2 XRD表征

3．2．3 富铜相的析出激活能

3．2．4 硬度

3．2．5 拉伸性能

3．3 Cu含量对316L-Cu不锈钢腐蚀性能的影响

3．3．1 点蚀和均匀腐蚀

3．3．2 亚稳态点蚀

3．3．3 阻抗谱

3．3．4 钝化膜分析

3．4 本章小结

4 316L-Cu不锈钢的促进内皮化及抗菌作用研究

4．1 引言

4．2 316L-Cu不锈钢促内皮化作用的体外研究

4．2．1 细胞增殖及凋亡

4．2．2 Cu／Zn-SOD释放

4．2．3 免疫荧光

4．2．4 内皮细胞的迁移

4．2．5 小管生成情况

4．2．6 与血管生成相关的基因表达

4．2．7 动态凝血实验

4．3 316L-Cu不锈钢的抗菌作用研究

4．3．1 杀菌率

4．3．2 细菌生物膜形成

4．3．3 细菌的生存状态

4．3．4 离子溶出

4．4 316L-Cu不锈钢的热处理工艺及Cu含量优化

4．5 316L-Cu不锈钢促内皮化作用的体内研究

4．5．1 QCA及OCT分析

4．5．2 植入部位的SEM表征

4．5．3 植入部位的HE染色

4．6 本章小结

5 L605-Cu合金的促进内皮化及抗菌作用研究

5．1 引言

5．2．1 细胞增殖、凋亡及细胞形态

5．2．2 细胞迁移及小管生成

5．2．3 VEGF和NO的分泌及基因表达

5．2．4 动态凝血实验

5．3 L605-Cu合金的抗菌作用研究

5．3．1 细菌生物膜形成

5．3．2 细菌的生存状态

5．3．3 离子溶出

5．4 Cu离子溶出与生物功能化作用的探讨

5．5 本章小结

6结论与展望

6．1 结论

6．2 创新点

6．3 展望

参考文献

攻读博士学位期间科研项目及科研成果

致谢

作者简介