免标记的自组装单宁酸涂层用于超高流速循环肿瘤细胞的捕获

摘要

循环肿瘤细胞（CTCs）是从原发肿瘤或转移灶脱落进入外周血血液循环的肿瘤细胞，其数量及类型与癌症的发生和发展密切相关。现阶段对于CTC的捕获主要利用抗原与抗体的相互作用，但其效果不佳。其主要原因是在抗原外部存在一层厚度为500nm左右的糖萼层，其大大阻碍了抗原和抗体的结合。本文模拟CTCs在血管内皮细胞膜表面的微转移机制，利用单宁酸膜与癌细胞膜上糖萼产生的强相互作用，介导癌细胞的滚动的同时，利于CTCs的粘附和捕获。这种使用单宁酸膜进行流动捕获CTCs的新方法，是目前报道中流速最快的并且不同于传统捕获的化学无标记动态捕获技术。本文主要进行了如下三项工作内容： （1）通过层层组装的方法，在玻璃基底上成功获得了单宁酸7层涂层；利用有机玻璃板和硅胶垫片成功搭建了可满足液体流通的平行板流动腔，通过模拟建模分析出流道内的壁面剪切力分布情况，并通过实际的细胞黏附实验验证了动态捕获检测的合理区域为中心区域。通过条件优化确定TA浓度为3.2mg/mL，Fe3+浓度为0.8mg/mL修饰的7层TA涂层更易于癌细胞的流动捕获，酚羟基的封闭会降低捕获效果。 （2）通过荧光显微镜对细胞的动态跟踪及分析，建立了促滚效应、粘附效应、粘附后抵抗快速流体冲击三种状态相应的检测指标。在此基础上，验证了与商业上常用的anti-EpCAM和E-selectin涂层相比，TA有优异的癌细胞动态捕获效果及白细胞排斥作用，并确定了单宁酸材料在40mL/h的高流速下癌细胞动态捕获效果最佳。 （3）首次实现在高流速下利用简单经济的平面流动腔通过多次循环提高癌细胞接触的CTCs捕获新策略。利用多酚表面成功构建了简单、捕获效率高的体外循环捕获系统，高流速循环流动可以增加CTC与基底的接触机会。确定以1.5mm的流道高度以及2h的循环捕获时间可以获得最佳的捕获效果，同时增大流道长度可以进一步提高捕获效果；在癌细胞模拟血样中，在高流速40mL/h稀有癌细胞捕获率为90%，背景白细胞3个/cm2，表明极高的癌细胞捕获纯度；对13个癌症晚期患者的1.5mL血样进行检测，检出率为100%，检出个数为2-25个/mL，不仅可捕获单个CTC，也可捕获CTC的细胞团。

目录

声明

引言

1 文献综述

1.1 循环肿瘤细胞及其体内微转移

1.1.1 循环肿瘤细胞

1.1.2 循环肿瘤细胞的特性

1.1.3 循环肿瘤细胞的体内微转移

1.2 循环肿瘤细胞的捕获方法

1.2.1 物理法

1.2.2 微纳米拓扑结构

1.2.3 免疫磁珠法

1.2.4 微流控技术

1.3 多酚材料

1.3.1 多酚的特性

1.3.2 多酚的理化性质及其材料设计原理

1.3.3 多酚的生物活性

1.4 本论文的研究内容及意义

2 多酚涂层表面的制备表征与流动腔模型构建

2.1 引言

2.2 实验材料

2.2.1 实验仪器

2.2.2 实验材料和试剂

2.3 实验方法

2.3.1 单宁酸涂层的制备

2.3.2 单宁酸涂层的表征

2.3.3 平行板流动腔的构建

2.3.4 平行板流动腔内壁压力分布分析

2.3.5 细胞培养

2.3.6 平行板流动腔的癌细胞流动捕获

2.3.7 单宁酸涂层不同修饰层数的捕获实验

2.3.8 单宁酸涂层不同浓度的捕获实验

2.3.9 金属离子封闭后的单宁酸涂层的癌细胞捕获实验

2.4 实验结果与讨论

2.4.1 单宁酸涂层的物理化学性质

2.4.2 平行板流动腔所受高流速流体壁面剪切力及细胞黏附分布

2.4.3 平行板流动腔用于癌细胞流动捕获的细胞黏附情况

2.4.4 单宁酸涂层修饰层数对捕获效果的影响

2.4.5 单宁酸涂层浓度对捕获效果的影响

2.4.6 金属离子封闭后的单宁酸涂层对捕获效果的影响

2.5 本章小结

3 单宁酸涂层用于癌细胞动态捕获的效果评价

3.1 引言

3.2 实验材料

3.2.1 实验仪器

3.2.2 实验材料和试剂

3.3 实验方法

3.3.1 细胞运动状态判定与计数方法

3.3.2 基底材料的修饰与表征

3.3.3 癌细胞的动态捕获实验

3.3.4 已捕获癌细胞稳定性测试

3.3.5 PBMCs的提取实验

3.3.6 PBMCs的动态捕获实验

3.4 实验结果与讨论

3.4.1 Anti-EpCAM抗体和E-selectin涂层的表征

3.4.2 单宁酸涂层对癌细胞的促滚作用

3.4.3 单宁酸涂层对癌细胞的捕获作用

3.4.4 捕获癌细胞的稳定性

3.4.5 抗PBMC黏附效果

3.5 本章小结

4 单宁酸涂层在模拟血液及癌症患者血液中癌细胞动态捕获的效果评价

4.1 引言

4.2 实验材料

4.2.1 实验仪器

4.2.2 实验试剂

4.3 实验方法

4.3.1 循环捕获系统的构建

4.3.2 探究流动腔高度变量对癌细胞循环捕获实验

4.3.3 探究流动腔长度变量对癌细胞循环捕获实验

4.3.4 探究循环捕获时间变量对癌细胞循环捕获实验

4.3.5 探究不同癌细胞投入量对癌细胞循环捕获实验

4.3.7 单宁酸涂层用于模拟血液中稀有癌细胞的循环捕获实验

4.3.8 单宁酸涂层用于癌症患者血液中癌细胞的循环捕获实验

4.4 实验结果与讨论

4.4.1 流动腔高度对循环捕获效果的影响

4.4.2 流动腔长度对循环捕获效果的影响

4.4.3 循环捕获时间对循环捕获效果的影响

4.4.4 不同癌细胞投入量对癌细胞循环捕获的影响

4.4.5 循环捕获系统的癌细胞捕获广谱性效果

4.4.6 单宁酸涂层用于模拟血液中稀有癌细胞的循环捕获评价

4.4.7 单宁酸涂层用于癌症患者血液中癌细胞的循环捕获评价

4.5 本章小结

结论

参 考 文 献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢

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