黄芩素和阿卡波糖体外调控糖尿病鼠肠道菌群

摘要

肠道微生物群作为人体内最复杂的微生态系统，在平衡宿主健康和疾病的过程中发挥着重要的作用。肠道微生物群失调会引发糖尿病等一系列代谢性疾病。近年研究表明，治疗糖尿病的临床药物和具有降血糖活性的天然产物都会影响肠道微生物的组成。对肠道微生物的调控成为未来治疗糖尿病的策略之一。课题组前期实验证明，黄芩素与阿卡波糖联用对α-葡萄糖糖苷酶具有协同抑制活性，并在体内具有协同降低糖尿病小鼠餐后血糖的作用。但是黄芩素和阿卡波糖联用调控肠道菌群的过程中，既包括黄芩素和阿卡波糖本身对肠道菌群的作用，也包括黄芩素和阿卡波糖作用下淀粉水解产物对肠道菌群的影响，而体内动物实验并不能区分这两种作用。针对以上问题，本论文开展了以下几项研究： 首先通过建立寡糖检测方法和构建淀粉体外水解体系，对阿卡波糖和黄芩素单用及联用抑制α-葡萄糖糖苷酶生成的淀粉水解产物的组成进行分析。阿卡波糖和黄芩苷元对淀粉为底物的小鼠小肠混合酶的IC50值分别为0.36±0.08μM和303.44±16.12μM，并且具有协同抑制作用，其联用指数CI值在0.43~0.58之间。阿卡波糖和黄芩素抑制α-葡萄糖糖苷酶生成的淀粉水解产物有所不同，且这种差异会随着抑制剂浓度的增加而增大。抑制率为80%时，阿卡波糖抑制组和黄芩苷元抑制组中葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖和淀粉的比例分别是1∶0.4∶1.6∶3.1∶10和1∶2.7∶3.1∶5.2∶1.2。 其次构建了肠道微生物的体外培养模型，评价了YCFA、BNM和GAM三种培养基中小鼠肠道微生物群的结构和功能。结果表明，GAM培养基中微生物的数量和产生的短链脂肪酸浓度最高，微生物群多样性显著高于YCFA和BNM培养基。GAM培养基中微生物群组成与粪便微生物群组成最接近，所以选择GAM培养基为最适培养基，培养条件为液体培养，1%接种，37℃下200rpm/min摇瓶培养24h。 最后考察了阿卡波糖和黄芩素体外调控肠道微生物的机制。相关性分析表明Bacteroides与发酵产气呈显著正相关性；Odoribacter、Morganella、Muribaculaceae与短链脂肪酸呈显著正相关性。阿卡波糖和黄芩素及其作用下的淀粉水解产物可以增加微生物多样性，增加Bacteroidetes与Fiemicutes的比例，增加SCFA的产量。阿卡波糖作用的淀粉水解产物显著增加Bacteroides从而增加产气量，黄芩素可以降低氢气比例。 本研究证明了阿卡波糖和黄芩素可以影响淀粉水解产物来调控肠道微生物群，为考察阿卡波糖和黄芩素体内调控肠道微生物群改善糖尿病提供研究基础。

目录

声明

1 文献综述

1.1 肠道微生物

1.1.1 肠道微生物概述

1.1.2 肠道微生物与健康

1.2 肠道微生物失调与疾病

1.2.1 糖尿病

1.2.2 胃肠疾病

1.2.3 其他疾病

1.3 药物干预糖尿病肠道微生物群

1.3.1 阿卡波糖

1.3.2 药物联用

1.3.3 其他药物

1.3.4 天然产物

1.3.5 微生物制剂

1.4 研究肠道微生物的技术手段

1.4.1 体外培养

1.4.2 变性梯度凝胶电泳

1.4.3 FISH和qPCR

1.4.4 高通量测序

1.4.5 宏基因组学

1.5 本论文主要研究思路

2 黄芩素和阿卡波糖协同抑制淀粉水解的产物分析

2.1 绪论

2.2 实验材料与仪器

2.2.1 实验动物

2.2.2 实验材料与仪器

2.2.3 实验试剂的配制

2.3 实验方法

2.3.1 寡糖和淀粉的分析方法建立

2.3.2 小鼠小肠酶的制备及其α-葡萄糖苷酶活性测定

2.3.3 淀粉水解条件优化

2.3.4 淀粉水解的抑制试验

2.3.5 协同抑制的评价方法

2.4 结果与讨论

2.4.1 寡糖和淀粉的分析方法建立

2.4.2 淀粉水解条件的优化

2.4.3 阿卡波糖和黄芩素对淀粉水解的抑制实验

2.4.5 不同抑制剂浓度对淀粉水解产物的影响

2.4.6 不同反应体系体积对淀粉水解产物的影响

2.5 本章小结

3 肠道微生物的体外培养

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 实验动物

3.2.2 实验材料与仪器

3.2.3 实验试剂的配制

3.3 实验方法

3.3.4 DNA提取和高通量测序

3.3.5 生物信息学分析

3.4 结果与讨论

3.4.1 短链脂肪酸和气体成分测定方法的建立

3.4.2 培养基的筛选

3.5 本章小结

4 黄芩素和阿卡波糖对肠道微生物的调控作用

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 实验动物

4.2.2 实验材料与仪器

4.3 实验方法

4.3.1 肠道微生物的体外培养

4.3.2 发酵液短链脂肪酸的测定

4.3.3 气体成分的测定

4.3.4 DNA提取和高通量测序

4.3.5 生物信息学分析

4.4 结果与讨论

4.4.1 实验分组设计

4.4.2 短链脂肪酸含量的影响

4.4.3 对产气量的影响

4.4.4 对肠道微生物群的影响

4.4.5 肠道微生物群的相关性分析

4.4.6 阿卡波糖和黄芩素联用降糖的肠道菌群机制

4.5 本章小结

结论

展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢

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