基于两性离子聚合物的抗体快速纯化材料的创制

摘要

亲和配基是亲和层析法分离蛋白的关键，而现有的蛋白A分离配基存在稳定性差、价格昂贵等问题，而合成类的小分子亲和配基存在着特异性差等问题。寻找可以替代蛋白A分离配基，兼具高选择性、耐酸、碱洗涤再生的合成小分子亲和配基一直是抗体纯化分离行业的难点和重点。本研究中提出了一类新型配基结构，并开展了以下工作。 首先通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合方法合成了磺酸甜菜碱聚合物（pSBMA），并通过进一步反应得到pSBMA的两种衍生物，单端巯基的磺酸甜菜碱聚合物（pSBMA-SH）和单端砜基的磺酸甜菜碱聚合物（pSBMA-VS）。然后将两性离子聚合物利用一步法和两步法修饰到磁性纳米粒子表面，得到了一步修饰的纳米粒子（1S NPs）和两步修饰的纳米粒子（2S NPs）。以人免疫球蛋白（hIgG）和牛血清白蛋白（BSA）作为模型蛋白，利用1S NPs和2S NPs进行蛋白质静态吸附实验。结果显示1S NPs表面呈现出对蛋白的抗吸附性能，2S NPs表面可以选择性吸附hIgG。接着，以2S NPs作为分离介质，考察了分离介质中二乙烯基砜（DVS）修饰时间、抗蛋白非特异性吸附链材料、抗蛋白非特异性吸附链长、承载介质尺寸和抗体分离条件（蛋白溶液pH和盐的种类及浓度）对两种蛋白吸附的影响。采用优化后的实验条件，利用分离介质在模拟血清和牛血清中分离hIgG，结果表明分离介质可以在复杂的生物流体中选择性的吸附hIgG。多次使用、重生之后分离介质依然保持了良好的选择性吸附抗体的性能。 利用BLI生物传感技术进一步研究了亲和配基和蛋白的相互作用。利用两步法修饰传感器探头，以hIgG和BSA作为模型蛋白，进行蛋白的动态吸附实验。结果表明两步法修饰的探头可以选择性吸附hIgG。利用Langmuir方程拟合得到了亲和配基吸附hIgG过程中的解离平衡常数为0.18mg/mL（1.2×10-6M）。同时化学修饰的探头可以在较高杂蛋白浓度下选择性吸附hIgG。修饰后的探头在经过五次使用后探头选择性吸附hIgG的能力并没有明显降低，也说明制备的亲和配基有非常好的稳定性。通过实验确定了新型亲和配基和hIgG的作用位点在hIgG的Fab片段。

目录

声明

1 绪论

1.1 前言

1.2 亲和层析法

1.2.1 生物亲和层析

1.2.2 免疫亲和层析

1.2.3 金属离子亲和层析

1.2.4 拟生物亲和层析

1.3 亲和层析配基

1.3.1 天然生物分子亲和配基

1.3.2 合成分子亲和配基

1.4 基于嗜硫作用的新型亲和配基的设计与构筑

1.5 两性离子聚合物

1.6 可逆加成-断裂链转移聚合技术

1.7 本论文研究目的及研究内容

2 两性离子聚合物修饰的磁性纳米粒子的制备及表征

2.1 引言

2.2 实验仪器与试剂

2.3 实验操作

2.3.1 两性离子聚合物及其衍生物的制备

2.3.2 利用一步法和两步法制备功能化的磁性纳米材料

2.3.3 核磁表征

2.3.4 水相GPC分析

2.3.5 磁性纳米粒子表面膜电位表征

2.3.6 磁性纳米粒子水力学直径表征

2.3.7 X射线光电子能谱表征

2.4 实验结果与讨论

2.4.1 核磁表征

2.4.2 水相GPC分析

2.4.3 磁性纳米粒子表面膜电位表征

2.4.4 磁性纳米粒子水力学直径表征

2.4.5 X射线光电子能谱表征

2.5 小结

3 功能化的纳米粒子抗体吸附行为的研究

3.1 引言

3.2 实验仪器与试剂

3.3 实验操作

3.3.1 蛋白静态吸附实验

3.3.2 不同修饰过程对蛋白吸附的影响

3.3.3 二乙烯基砜不同修饰时间对抗体吸附的影响

3.3.4 PEG和pMPC修饰的磁性纳米粒子抗体吸附性能对比

3.3.5 不同链长的聚合物链对抗体吸附的影响

3.3.6 磁性纳米粒子尺寸对抗体吸附的影响

3.3.8 不同盐种类和盐浓度对抗体吸附的影响

3.3.9 2S NPs的重复使用能力

3.3.10 2S NPs从模拟血清中分离hIgG

3.3.11 2S NPs从牛血清中分离hIgG

3.4 实验结果与讨论

3.4.1 不同修饰过程对抗体吸附的影响

3.4.2 二乙烯基砜修饰时间对抗体吸附的影响

3.4.3 PEG和pMPC修饰的磁性纳米粒子抗体吸附性能对比

3.4.4 不同分子量的pSBMA链对抗体吸附的影响

3.4.5 磁性纳米粒子尺寸对抗体吸附的影响

3.4.6 溶液pH对抗体吸附的影响

3.4.7 不同盐种类和盐浓度对抗体吸附的影响

3.4.8 2S NPs的重复使用能力

3.4.9 2S NPs从模拟血清中分离hIgG

3.4.10 2S NPs从牛血清中分离hIgG

3.5 小结

4 基于BLI生物传感技术的亲和配基的研究

4.1 引言

4.2 实验仪器与试剂

4.3 实验操作

4.3.1 亲和配基在Blitz传感探头表面上的固定

4.3.2 BLI生物传感器实验

4.3.3 基于BLI生物传感器蛋白的等温吸附曲线

4.3.4 不同BSA浓度对hIgG的选择性吸附影响

4.3.5 BLI生物传感器在牛血清中对hIgG的选择性吸附影响

4.3.6 利用BLI生物传感技术探究亲和配基重复使用能力

4.3.7 亲和配基和hIgG的相互作用位点研究

4.4 实验结果与讨论

4.4.1 基于BLI生物传感器蛋白质动态等温吸附曲线

4.4.2 不同BSA浓度对hIgG的选择性吸附影响

4.4.3 BLI生物传感器在牛血清中对hIgG的选择性吸附影响

4.4.4 利用BLI生物传感技术探究亲和配基重复使用能力

4.4.5 亲和配基和hIgG的相互作用位点研究

4.5 小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢

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