T淋巴细胞γ-H2AX微流控芯片免疫染色技术研究

摘要

微流控芯片(Microfluidic chip)是一种微型化、集成化的技术平台。它能把整个生物或化学过程整合到一个只有几平方厘米的芯片上，并且易于自动化操控。应用微流控技术进行实时现场生物标志物监测是作为健康评估的一个有前景的技术。γ-H2AX荧光标记技术能够检测T淋巴细胞的辐射损伤，可以为实施现场评估辐射损伤提供重要的监测靶目标。本研究为实现在芯片上自动化操控T淋巴细胞进行γ-H2AX免疫荧光标记的过程，研究了免疫磁珠结合淋巴细胞在芯片上的驱动作用、γ-H2AX免疫荧光标记芯片的设计和优化、利用人CD4细胞进行UVC紫外线辐射产生DNA的γ-H2AX荧光标记及其在芯片上实现特异性标记反应。
　　研究表明，利用永久磁铁带动2.8μm磁珠既满足磁铁带动CD4淋巴细胞在芯片上的拖动，又不影响辐照产生的γ-H2AX相对荧光强度与辐照剂量的线性关系。本研究优化了在芯片上实现CD4淋巴细胞γ-H2AX免疫的反应池和间隔池的数量分别为6个和5个，确立了各个反应池的反应试剂量，确立了细胞与磁珠结合比为1/10，细胞上样量为2×105。在芯片上通过永久磁铁拖动结合了磁珠的淋巴细胞实现了对CD4淋巴细胞γ-H2AX免疫特异性荧光标记。通过对不同剂量(0、16、32、64J/m2)的UVC紫外辐照后的淋巴细胞的γ-H2AX相对荧光强度分析，获得的相关系数为0.9517，证实利用该技术可以监测到辐射损伤与辐照剂量的线性关系。
　　本研究可以为微流控芯片自动免疫荧光染色装置以及便携式细胞生物学实验仪器的开发提供基础参数。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 研究背景

1．1．1 空间辐射

1．1．2 微重力

1．2 辐射损伤及其生物标志物

1．2．1 辐射损伤

1．2．2 辐射损伤生物标志物

1．3 组蛋白及γ-H2AX简介

1．3．1 H2A组蛋白家族

1．3．2 γ-H2AX

1．3．3 γ-H2AX生物学检测方法

1．4 微流控技术

1．4．1 压力驱动技术

1．4．2 电驱动技术

1．4．3 免疫磁珠驱动技术

1．5 人CD4+T淋巴细胞

1．6 研究目的及意义

第2章 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验设备及仪器

2．3 主要试剂

2．4 实验方法

2．4．1 CD4细胞培养

2．4．2 CD4细胞复苏

2．4．3 CD4细胞冻存

2．4．4 CD4细胞传代

2．4．5 UVC辐射处理

2．4．6 PMMA芯片的加工方法

2．4．7 磁珠与CD4细胞结合

2．4．8 CD4细胞γ-H2AX免疫荧光标记方法

2．4．9 芯片外细胞-磁珠γ-H2AX免疫荧光标记方法

2．4．10 芯片上细胞-磁珠γ-H2AX免疫荧光标记原理

2．4．11 以磁珠为载体的微流控芯片反应池数量的确定方法

2．4．12 以磁珠为载体的微流控芯片上样量的分析

2．4．13 微流控芯片结构优化

第3章 结果与讨论

3．1 分析在芯片上能有效结合细胞的磁珠大小和比例

3．2 磁珠对γ-H2AX相对荧光强度的影响

3．2．1 小磁珠与细胞结合对UVC诱导γ-H2AX荧光强度的影响

3．2．2 中磁珠与细胞结合对UVC诱导γ-H2AX荧光强度的影响

3．2．3 大磁珠与细胞结合对UVC诱导γ-H2AX荧光强度的影响

3．3 芯片上γ-H2AX免疫荧光标记反应池数量的优化

3．5 应用方形反应池芯片的γ-H2AX相对荧光标记和辐射剂量关系

3．6 应用椭圆形反应池芯片上γ-H2AX相对荧光强度与辐照剂量关系

3．7 方形和椭圆形反应池芯片设计对γ-H2AX荧光标记的特异性影响

3．8 本章小结

结论

参考文献

致谢

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