重离子辐射诱发水稻生物学剂量效应机制研究

摘要

高剂量辐射引起的生物学损伤在表型上随剂量增加而呈现剂量依赖性增加，而低剂量辐射没有这种剂量依赖性规律，推测高低剂量辐射诱发生物学效应可能是启动了不同的抗逆调控机制。大量研究已证实，高低剂量辐射都会诱发表观遗传学的变化，反映了表观遗传学变化可能是参与抗胁迫的重要机制，但这些变化与剂量生物学效应的关系仍然不清楚。因此，本文从表观遗传学调控机制的角度入手，系统地比较高低剂量辐射诱导水稻基因组甲基化整体变化特征，及其功能基因组表达及蛋白质变化的规律，特别是编码转录因子、转座子和甲基化转移酶的DNA甲基化变化与对应的基因表达变化特征，对于认识不同剂量诱发生物学效应的分子机制非常关键。本论文首先通过0，0.01，0.02，0.1，0.2，1，2，5和20Gy(能量为165MeV/u，LET为30keV/μm，剂量率为0.5Gy/min)辐射处理水稻干种子，应用植物生长性状分析、双向电泳和DNA甲基化多态性检测技术，对每个处理组表型和分蘖期叶片蛋白质表达模式与基因组甲基化变化，进行覆盖高低剂量范围的不同剂量处理的特征分析。在此基础上，选取低剂量和高剂量代表组，进一步利用高通量测序技术分析辐射处理后三叶期，水稻植株的基因组甲基化、功能基因组、蛋白质组变化的特征，比较植物不同发育阶段的动态变化规律。同时利用生物信息学分析手段解析了基因组甲基化变化与甲基化转移酶表达调控变化，转录因子和转座子编码基因的甲基化变化与对应关联功能基因的变化，及影响能量代谢和抗逆胁迫相关功能基因及其蛋白质变化特征，在高低剂量处理组的区别，揭示高低剂量辐射诱导胁迫水稻干种子，分别在三叶期和分蘖期发育阶段，由基因组甲基化变化参与抗逆胁迫调控的规律和途径。具体获得了如下几方面的结果: (1)高低剂量重离子辐射水稻干种子后发育到分蘖期，叶片蛋白质表达谱主成分分析表明，仍能以1-2Gy为高低剂量的分界点，表现了低剂量辐射组蛋白质表达与对照组更接近，而高剂量辐射组蛋白质表达与对照组差异较大。从发生DNA甲基化改变的基因和差异表达蛋白质的功能分析表明，在高低剂量都影响代谢水平相关的功能分子基础上，高剂量诱导了水稻蛋白质定位，转运及胁迫应答过程的变化; (2)高低剂量处理水稻干种子诱导的DNA甲基化变化分析表明，三叶期表现为无论高低剂量重离子辐射都诱导了CG和CHH位点去甲基化变化多于甲基化变化，但发育到分蘖期，在高低剂量处理组CHH位点仍然保持去甲基化变化多于甲基化变化，但低剂量处理组诱导CG位点发生甲基化变化多于去甲基化变化的动态改变，提示高低剂量重离子辐射水稻种子诱发的基因组甲基化水平的改变，伴随着发育发生了动态变化的是其基因组CG位点上甲基化水平，低剂量处理组相对高剂量处理组，能够在分蘖期时就发生恢复性的变化; (3)高低剂量重离子辐射引起功能基因表达谱的变化分析表明，由RdDM介导基因组甲基化，参与将双链RNA切割成24nt siRNA的DCL表达下调，同时，负责与RNA-RNA或RNA-DNA交互作用的AGO3表达下调;参与CG位点从头甲基化及维持CG位点甲基化的MET1上调表达，而参与维持非CG位点甲基化的CMT3下调表达，反映了重离子辐射诱发的三叶期水稻DNA甲基化水平下降可能与这些甲基化酶多数下调表达有关; (4)高低剂量辐射处理水稻种子发育至三叶期时，水稻转录因子表达存在不同，低剂量与高剂量处理组相比以下调为主。分析表明，C2C2(Zn)DOF zinc finger family,C3H zinc finger family,MYB-related,NAC domain,AtSR,Aux/IAA,GeBP like及SET-domain8类转录因子家族只在低剂量辐射组发生表达改变，而TCP和CCAAT box binding factor family类转录因子家族只在高剂量辐射组发生表达改变。这些改变表现为低剂量相对高剂量主要抑制了转录因子对应的能量代谢相关的基因的表达，而高剂量组通过提升脂类代谢相关的转录因子表达参与抗胁迫，说明高低剂量重离子辐射可能通过启动不同的转录因子调节靶基因的表达变化，调控不同的应答途径响应辐射胁迫; (5)高低剂量辐射处理水稻种子发育至三叶期时，DNA去甲基化的转座子的邻近基因的功能分析表明，低剂量辐射组中，DNA类型转座子邻近的下调表达基因参与蛋白磷酸化，LTR类型转座子邻近的下调表达基因参与氧化还原反应及胁迫应答等相关功能;而高剂量辐射组中，LTR类型转座子邻近的下调表达基因参与蛋白磷酸化、氧化还原反应及转录调控等相关功能，上调表达基因参与胁迫应答及转录调控等相关功能，DNA类型转座子邻近的上调表达基因参与氧化还原反应等相关功能。说明高低剂量辐射处理水稻干种子发育到三叶期通过转座子活跃参与了抗胁迫的调控，其中，低剂量处理组以下调为主，而高剂量处理组表现了更多的上调变化。

目录

声明

摘要

第1章绪论

1．1空间辐射环境简介

1．2低剂量辐射的生物学效应特点

1．3植物DNA甲基化调控生长发育的机制

1．3．1植物DNA甲基化简介

1．3．2辐射胁迫对生物DNA甲基化的影响

1．3．3生物DNA甲基化与基因表达的关联

1．4植物转录因子参与抗逆调控的作用机制

1．5植物转座子参与辐射诱导的基因组不稳定性研究

1．6重离子辐射诱导生物学剂量效应机制研究的目的和意义

1．7本课题研究的主要内容

1．8本课题的研究路线

第2章材料与方法

2．1实验材料

2．1．1重离子辐射处理水稻材料

2．1．2水稻材料的种植培养

2．2主要仪器设备及试剂

2．2．1仪器设备

2．2．2酶及试剂

2．2．3溶液与培养基

2．3实验方法

2．3．1表型数据及农艺学性状的获取

2．3．2 MSAP技术检测基因组CCGG位点甲基化

2．3．3差异条带的回收与纯化

2．3．4克隆测序

2．3．5蛋白质双向电泳实验

2．3．6水稻全基因组甲基化重亚硫酸盐测序

2．3．7水稻转录组测序

2．3．8实时定量荧光PCR检验

2．3．9液质联用技术分析水稻蛋白质组

2．3．10生物信息学分析

2．3．11质控结果

第3章不同剂量重离子辐射诱发分蘖期水稻DNA甲基化及功能分子的变化

3．1不同剂量重离子辐射诱发水稻表型及蛋白质的变化

3．1．1不同剂量重离子辐射诱发水稻株高表型的变化

3．1．2不同剂量重离子辐射诱发水稻成熟期农艺学性状的变化

3．2不同剂量重离子辐射诱发水稻蛋白质的变化

3．2．1不同剂量重离子辐射诱发水稻蛋白质表达模式的变化

3．2．2不同剂量重离子辐射诱导水稻的差异表达蛋白及其功能分析

3．3不同剂量重离子辐射诱发水稻基因组甲基化的变化

3．3．1不同剂量重离子辐射诱发水稻基因组甲基化的变化

3．3．2不同剂量重离子辐射引起水稻甲基化多态性条带测序信息

3．4讨论

3．5小结

第4章高低剂量重离子辐射诱发三叶期水稻的功能分子变化

4．1高低剂量重离子辐射对水稻蛋白质组的影响

4．1．1水稻总蛋白质的提取

4．1．2高低剂量重离子辐射后水稻蛋白质的功能分析

4．1．3高低剂量重离子辐射后水稻蛋白质组主成分分析

4．1．4高低剂量重离子辐射诱发水稻差异表达蛋白质的数目

4．1．5高低剂量重离子辐射诱发水稻差异蛋白质的功能分析

4．2高低剂量重离子辐射对三叶期水稻基因表达的影响

4．2．1三叶期水稻RNA样品的提取与质量检测

4．2．2测序eDNA文库构建及测序原始数据质量评估

4．2．3测序数据与水稻参考基因组的比对分析

4．2．4高低剂量重离子辐射诱发水稻基因表达差异的分析

4．2．5高低剂量重离子辐射诱发水稻差异基因的功能分析

4．2．6高低剂量重离子辐射诱发水稻代谢通路的变化

4．2．7高低剂量重离子辐射诱发水稻代谢途径及功能的变化

4．2．8高低剂量重离子辐射诱发水稻胁迫应答基因差异的变化

4．2．9高低剂量重离子辐射诱发水稻转录因子的变化

4．3讨论

4．3．1高低剂量重离子辐射对水稻蛋白质的影响

4．3．2高低剂量重离子辐射对水稻基因表达的影响

4．4小结

第5章高低剂量重离子辐射对三叶期水稻DNA甲基化的影响

5．1高通量测序后的数据统计和覆盖率分析

5．2高通量测序后的全基因组甲基化胞嘧啶特征

5．3高通量测序后的基因组区域的甲基化分布

5．4高通量测序后的基因组各转录元件的DNA甲基化水平

5．5高低剂量重离子辐射诱发水稻基因组甲基化区域的差异

5．6讨论

5．6．1高低剂量重离子辐射对水稻DNA甲基化的影响

5．6．2高低剂量重离子辐射对不同发育阶段水稻DNA甲基化的影响

5．7小结

第6章高低剂量重离子辐射引起水稻DNA甲基化改变及其对转录调控的影响

6．1高低剂量重离子辐射影响水稻甲基化及基因表达变化的关联分析

6．2辐射诱发水稻转座子甲基化变化对邻近基因表达的影响

6．3辐射诱发水稻转录因子基因甲基化变化对靶基因表达的影响

6．4辐射后水稻甲基化相关基因表达对基因组甲基化的影响

6．5讨论

6．5．1高低剂量辐射引起水稻DNA甲基化改变及对转录的影响

6．5．2编码转座子及转录因子DNA甲基化参与基因转录表达

6．5．3辐射诱导水稻甲基化相关基因表达改变对基因组甲基化的影响

6．5．4高低剂量重离子辐射诱发不同发育阶段的水稻生物学效应变化

6．5．5高低剂量诱发基因组甲基化变化参与调控辐射剂量效应的机制

6．6小结

结论

展望

参考文献

附录

攻读学位期间公开发表论文

致谢

作者简介