紫花芸豆胰蛋白酶抑制剂分离纯化及部分性质研究

摘要

胰蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质，在抗虫转基因植物中占有十分重要的位置，同时也是研究蛋白质结构，特别是一级结构与其功能关系的良好模型，而且胰蛋白酶抑制剂在生理上具有重要调节作用，在肿瘤抑制方面有潜在应用价值，因此寻找新型的、高活性的胰蛋白酶抑制剂具有重要的理论价值和应用价值。 本论文以菜豆的一个栽培品种紫花芸豆为材料，从中分离纯化胰蛋白酶抑制剂PVTI，并对其部分性质进行了研究。具体结果如下： 1、优化了PVTI的粗提条件。将紫花芸豆磨碎乙醚脱脂后制成花豆粉，用pH4.0的稀酸溶液抽提，并在70℃对抽提液热变性15min，取上清，调pH8.0进行40～70％饱和度的硫酸铵分级沉淀。 2、粗提液依次经DEAESepharoseFastFlow离子交换层析和SephadexG100凝胶过滤层析，分离得到胰蛋白酶抑制剂PVTI。PAGE和IEF电泳显示单一条带。动力学的方法检测PVTI与胰蛋白酶发生不可逆抑制作用。凝胶过滤法测定其表观分子量约为59kDa。SDS电泳结果显示它有三个亚基，分子量分别为34kDa、16kDa和15kDa。等电聚焦法测定其等电点为5.25。PVTI的分子量、等电点与菜豆中已报道的抑制剂不同。 3、紫外扫描显示PVTI在250nm～280nm处只有一个吸收平台，说明PVTI只含有少量的芳香族氨基酸。 4、探索了不同温度、不同还原剂和变性剂处理对PVTI抑制活性和蛋白构象的影响。活性和内源荧光光谱测定结果表明：未处理的PVTI中的Trp残基位于疏水部位；PVTI在100℃处理60min后，活性能保留约70％，说明PVTI是一种对热稳定的蛋白；低浓度DTT处理使PVTI活性降低，推测PVTI分子肽链表面含有二硫键，且部分对活性中心有贡献；当DTT的浓度增加到14.3mmol/L，PVTI的抑制活性明显降低，推测此时对活性中心有重要贡献的二硫键被还原；经8mol/L的尿素处理后，PVTI的荧光光谱没有明显变化，但残留了较少的抑制活性，可能是亚基的解离影响了抑制活性而每个亚基的内部结构未受到影响；经6mol/L盐酸胍处理，Trp残基完全暴露于极性环境中，整个蛋白质分子处于一种松散伸展的状态，PVTI活性全部丧失。进一步证明PVTI的芳香族氨基酸位于分子内部的疏水区。

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一.前言

二.实验部分

参考文献

致谢