pEGFP-N-VEGF基因转染的骨髓间充质干细胞与PLGA材料相容性

摘要

目的：探讨转染pEGFP-N2-VEGF（携带增强型绿色荧光蛋白的血管内皮生长因子基因）后的骨髓间充质干细胞与PLGA（聚乳酸/乙醇酸共聚物）材料的相容性。 方法：1、原代培养以密度梯度离心法获得兔骨髓间充质干细胞，常规换液、传代、冻存与复苏，流式细胞仪检测其细胞周期；2、将含pEGFP-N2-VEGF基因质粒的大肠杆菌菌种摇菌过夜，以无内毒素大提试剂盒提取质粒，用紫外分光光度法及琼脂糖电泳检测其浓度及纯度；3、用脂质体包埋法将pEGFP-N2-VEGF基因转入骨髓间充质干细胞，PCR检测转染效果，免疫组织化学观察是否有蛋白表达；4、同法转染接种于PLGA种植模型上的骨髓间充质干细胞，分别利用荧光显微镜及扫描电镜进行观察；5、MTT（四唑盐比色实验）检测转染pEGFP-N2-VEGF前后细胞活力，分4组：①骨髓间充质干细胞组、②转染pEGFP-N2-VEGF骨髓间充质干细胞组、③骨髓间充质干细胞+PLGA组、④转染pEGFP-N2-VEGF骨髓间充质干细胞+PLGA组。 结果：1、原代骨髓间充质干细胞呈细长梭形，克隆样生长；多次传代后出现老化现象，细胞变扁平。流式细胞术示第二代的骨髓间充质干细胞90％以上的细胞都处于G0/G1期。而第六代骨髓间充质干细胞G0/G1期约占80％左右。2、紫外分光光度法示摇菌后获得的pEGFP-N2-VEGF质粒溶度为1380μg/ml，琼脂糖电泳可见相应条带；3、pEGFP-N2-VEGF基因转入骨髓间充质干细胞后，PT-PCR检测可有特征性的扩增条带出现，与DNAmark相比较，条带位置相符；48h后行细胞免疫化学染色，VEGF抗体反应呈阳性。4、转基因后可以在荧光显微镜、扫描电镜下较好的观察细胞与材料之问的相互作用；5、MTT示转染前后4组各孔光吸收值在492nm波长时分别为：0.309±0.113、0.350±0.176、0.295±0.112、0.336±0.172；在629nm波长时依次为0.104±0.036、0.121±0.050、0.085±0.035、0.102±0.053，①组与②组、③组与④组在统计学上都无统计学意义（p>0.05）。 结论：1、密度梯度离心法可获得足够数量较强分化潜能的骨髓间充质干细胞；2、骨髓间充质干细胞转染pEGFP-N2-VEGF基因后可在分子和蛋白层次获得表达；3、转染pEGFP-N2-VEGF基因可作为标记骨髓间充质干细胞的一种有效方式，为动态脱察细胞与材料之间的相互作用打下了一定的基础；4、转染pEGFP-N2-VEGF基因不影响骨髓间充质干细胞在PLGA材料上的活力，为血管组织工程研究提供了一种新的手段。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:符号说明

声明

第1章引言

第2章材料

2.1实验动物

2.2试剂

2.3主要试剂配制

2.4主要仪器设备

2.5支架材料

第3章方法

3.1实验流程

3.2骨髓间充质干细胞培养

3.2.1骨髓间充质干细胞原代培养

3.2.2BMSC细胞的冻存

3.2.3BMSC细胞复苏

3.2.4流式细胞术检测

3.3含pEGFP-N2-VEGF基因质粒的提取与纯化

3.4利用脂质体将pEGFP-N2-VEGF基因转入骨髓间充质干细胞

3.5 RT-PCR检测转染细胞

3.5.1诱导细胞总RNA抽提

3.5.2逆转录(RT)反应

3.5.3 PCR扩增

3.5.4 PCR扩增引物系列

3.6免疫组织化学

3.6.1细胞涂片的准备

3.6.2免疫细胞化学染色

3.7在PLGA种植型上种植骨髓间充质干细胞转染EGFP-VEGF基因

3.8 MTT比色实验

3.9统计学处理

第4章结果

4.1细胞培养

4.2质粒DNA浓度及纯度检测

4.3 RT-PCR反应

4.4免疫细胞化学染色

4.5荧光显微镜、扫描电镜观察

4.6 MTT比色实验

第5章讨论

5.1种子细胞选择

5.2基因转染标记种子细胞的优点

5.3支架材料的使用

第6章 结论

致 谢

参考文献

附 图

综述 小口径血管构建--回顾与展望

攻读学位期间的研究成果