伊马提尼对K562细胞Bcl-X基因前体mRNA选择性剪接的调控

摘要

研究目的：
　　 选择性剪接是指在多细胞组织不同发育阶段和不同外界环境刺激变化过程中，细胞选择性地对pre-mRNA(前mRNA)剪接位点的组合剪接加工，形成不同的成熟mRNA，从而使一个基因产生若干有独特结构和功能的蛋白异构体的过程，它是真核生物控制基因表达的一种重要机制。外界因子通过信号转导对选择性剪接进行调控，并最终可能通过相应pre-mRNA应答元件实现这种调控。Bcl-x是Bcl-2家族成员之一，在细胞增殖、分化、凋亡过程中起着很重要的作用，Bcl-x通过选择性剪接可以产生Bcl-xl和Bcl-xs两种异构体，前者抗凋亡，后者促凋亡。在不同组织、发育阶段和疾病中，Bcl-x受到调控不同，造成其产物Bcl-xs/Bcl-xl样式不同。在癌症和肿瘤中，Bcl-xl被过表达，而Bcl-xs却能提高细胞对化疗药物的敏感性。因此，了解Bcl-x的调控机理有重要的临床意义。然而，在外界因子调控细胞生长和凋亡的过程中，对Bcl-x前体mRNA是如何被调节还不甚清楚。本文探讨了伊马提尼对慢性粒细胞白血病细胞系K562中Bcl-x基因前体mRNA选择性剪接的调控以及该调控和蛋白磷酸酶-1的关系，同时还探索了羟基脲联合伊马提尼对Bcl-x选择性剪接的调控。
　　 研究方法：
　　 1.K562细胞增殖和凋亡检测：WST法检测对照组、伊马提尼组、羟基脲组及两者联合组对细胞的增殖抑制率；将K562细胞用Annexin V和碘化丙啶(PI)进行双染，用流式细胞仪检测细胞的凋亡率。
　　 2.药物作用：参照文献用药浓度和时间，伊马提尼、羟基脲以及两者联合分别作用于2×105/L浓度的K562细胞，24h后收集；为排除细胞内DNA不稳定性因素，伊马提尼作用前给予转录抑制剂DRB预处理1h，收集细胞；为探索蛋白磷酸酶-1(PP1)是否参与该调控，伊马提尼作用前给予calylin A和okadaic acid分别预处理细胞2h，最后收集细胞。
　　 3.RT-PCR检测Bcl-x mRNA的表达情况：将上述收集细胞提取总RNA，经逆转录得到cDNA，以该cDNA为模板设计特异性引物进行PCR反应，得到PCR产物琼脂糖凝胶电泳后结果用Quantity One4.6.2分析Bcl-xs/Bcl-xl比值。
　　 4.Western Blot检测Bcl-x的蛋白表达情况：伊马提尼处理K562细胞24h后收集细胞，提取细胞总蛋白，通过蛋白免疫印迹分析Bcl-xl和Bcl-xs的蛋白表达情况。
　　 5.以上结果以x±s表示，实验数据采用SPSS11.5软件进行统计学处理。采用方差分析进行统计检验，检验水准α=0.05。
　　 研究结果：
　　 1.WST法研究结果显示，羟基脲、伊马提尼单独及联合应用均可抑制K562细胞增殖，联合用药组比两单独用药组抑制率高(P<0.01)。流式细胞仪分析各组细胞的凋亡结果显示联合用药组比两单独用药组抑制率高(P<0.01)，与增殖抑制率结果相符。
　　 2.经Quantity One4.6.2软件分析条带灰度值分析，伊马提尼1μM，2μM和5μM诱导K562细胞后Bcl-xs/Bcl-xl比值与对照组、DMSO组之间均有统计学差异(P<0.01)，并随着伊马提尼浓度升高，Bcl-xs/Bcl-xl比值也增高。羟基脲能轻微诱导K562细胞Bcl-x剪接方式趋向于Bcl-xs，结果显示两者联合应用组诱导K562细胞后Bcl-xs/Bcl-xl比值比单独用药组高(P<0.01)。
　　 3.DRB预处理K562细胞后RT-PCR结果显示DRB能拮抗伊马提尼对Bcl-x的调控，这种作用具有剂量依赖关系
　　 4.Calyclin A和Okadaic acid分别预处理K562细胞后RT-PCR结果显示Calyclin A能完全拮抗伊马提尼调控Bcl-x的剪接方式由Bcl-xl向Bcl-xs转移，而Okadaic acid组却无此效应。
　　 结论：
　　 在K562细胞中，伊马提尼能调控凋亡基因Bcl-x的选择性剪接，特异性地上调Bcl-xs，同时下调Bcl-xl的表达，这种调控具有剂量依赖关系，且证实该调控依赖于PP1活性，而联合羟基脲比单独用药该诱导转移更为显著。