经IL-10基因转化的大肠杆菌治疗小鼠结肠炎的实验研究

摘要

本文对经IL-10基因转化的大肠杆菌治疗小鼠结肠炎进行了实验研究。本研究分为两个部分：
　　 第一部分：IL-10基因转化大肠杆菌的研究。
　　 目的：利用小鼠白介素-10基因转化大肠杆菌，使所转化的细菌表达并分泌IL-10。
　　 方法：根据mIL-10的基因序列及大肠杆菌载体的多克隆位点，经过优化修饰mIL-10基因序列，合成新mIL-10编码基因序列，连接至原核表达载体pET32a+并测序，EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定目的基因片段的大小。用基因工程技术将含有mIL-10基因序列的pET32a+/mIL-10克隆到原核表达载体Origami B(DE3)，在体外经IPTG诱导表达，选择最佳的诱导条件。Western blot对目的蛋白进行鉴定，并探讨IL-10对LPS所诱导RAW264.7激活的抑制作用。
　　 结果：优化的mIL-10基因序列在氨基酸翻译上同源性为100％，重组的原核表达载体OrigamiB(DE3)/pET32a+mIL-10在体外可以高效表达，最佳的诱导时间为IPTG1mmol诱导3小时表达量最大，细菌培养基中可检测目的蛋白的表达，浓度为3.96ng/ml。Western blot检测目的蛋白具有良好的抗原反应性，IL-10能够有效抑制LPS对RAW264.7的激活作用，减少TNF的释放。
　　 结论：mIL-10转化大肠杆菌能表达具有生物学效应的IL-10。
　　 第二部分：IL-10基因转化的大肠杆菌对小鼠结肠炎的治疗研究。
　　 目的：研究经IL-10基因转化的大肠杆菌对DSS小鼠结肠炎肠道炎症的影响，并探讨其相关机制。
　　 方法：将IL-10基因转化的大肠杆菌简称为E.coli-IL-10，空质粒转化菌则简称为E.coli0：将小鼠随机分成6组：正常组对照组，DSS组，DSS+E.coli/IL-10组，DSS+E.coli0组，正常鼠+E.coli/IL-10组以及正常鼠+E.coli组。建立小鼠急性DSS结肠炎模型。自小鼠模型建立第1天开始，DSS+E.coli/IL-10组和正常鼠+E.coli/IL-10分别给予重组IL-10大肠杆菌1×108cfu/天灌胃至实验结束，DSS+E.coli和正常鼠+E.coli分别给予空质粒大肠杆菌灌胃至实验结束，正常对照组以及DSS组给于同等培养基灌胃至实验结束。每天观察各组疾病活动指数(DAI)，并在实验结束后检测各组小鼠炎症肠段肿瘤坏死因子(TNF)和髓过氧化物酶(MPO)等的含量，并测定小鼠结肠核因子(NF)-κB P65表达。
　　 结果：⑴DAI评分：DSS-E.coli/IL-10组小鼠的DAI评分与DSS组和DSS-E.coli0两组相比得分明显较低(P<0.05)，DSS-Ecoli0组与DSS组之间DAI得分无明显差异(P>0.05)；对照组与正常鼠+Ecoli0、正常鼠+Ecoli/IL-10间3组DAI得分均为0。⑵组织学评分：DSS-Ecoli/IL-10(6.22±3.30)低于DSS组和DSS-Ecoli0[(10.54±4.15)和(10.0±3.00)](P<0.05)，后两者直接得分无统计学差异(P>0.05)；饮用DSS水各组均高于对照组(0.88±0.31)(P<0.05)。⑶MPO活性：DSS+E.coli/IL-10组(2.35±0.39)明显低于DSS组和DSS+Ecoli0组[(4.15±0.77)和(3.5±1.23)](P<0.05)，高于其他3组(P>0.05)。⑷组织匀浆TNF含量：DSS组(237.85±47.01)与DSS-Ecoli0(239.81±50.38)组之间无明显差异(P>0.05)，高于其他4组(P<0.05)；DSS-Ecoli/IL-10组(172.46±66.71)低于DSS组以及DSS-Ecoli0组(P<0.05)，高于对照组(P>0.05)。⑸结肠粘膜NF-κB表达：DSS-Ecoli/IL-10组小鼠粘膜中NF-κB的活性明显低于DSS组和DSS-Ecoli0组(P<0.05)，饮用DSS水的3组小鼠的粘膜NF-κB活性明显比饮用自来水的3组小鼠活性高，DSS组与DSS-Ecoli0两组间NF-κB活性无显著差异(P>0.05)。
　　 结论：利用经IL-10基因转化的大肠杆菌可以明显缓解DSS小鼠的结肠炎症损伤，减低MPO活性、抑制炎症肠段炎症细胞NF-κB的活化及炎性细胞因子的分泌。利用基因工程技术结合肠道共栖菌表达IL-10可以为IBD治疗提供一个新的方法。