抑癌基因pten在原始卵泡启动生长中的作用及机制

摘要

目的：
　　 本课题拟通过原始卵泡体外培养模型，探究调控原始卵泡启动生长的重要基因pten在原始卵泡的表达；利用携带pten-shRNA慢病毒载体转染离体卵巢，观察pten下调对原始卵泡启动生长的影响，进而探讨pten在原始卵泡启动生长中的作用及机制。
　　 方法：
　　 1.无菌条件下获取2日龄SD雌性大鼠卵巢，分别在Waymouth培养体系中培养0、4、8天。采用HE染色法观察0，4，8天卵巢中原始卵泡的表达和数量变化；采用PCR法观察pten mRNA在原始卵泡的表达；采用免疫组化法观察0，4，8天卵巢中PTEN蛋白在原始卵泡的定位和表达。
　　 2.有效干扰片段的筛选，pten-shRNA慢病毒的包装，选择最佳感染时间和最佳感染复数(MOI：感染时病毒和细胞数量的比值)，应用RT-PCR和western blot法验证pten-shRNA慢病毒基因沉默效率。应用荧光显微镜观察GFP表达变化，并放射免疫检测0，4，8天培养液中激素含量的变化。
　　 3.应用PI3K抑制剂LY294002，慢病毒转染最佳干扰片段pten-shRNA。应用HE染色法观察各处理组原始卵泡启动生长发育，用RT-PCR法观察ptenmRNA的表达含量的变化，用western blot观察PTEN蛋白的表达变化及信号通路PI3K蛋白的表达变化。
　　 结果：
　　 1.原始卵泡数在卵泡总数中的比例随着培养天数的增加而减少；pten mRNA在原始卵泡中有表达，随着卵泡的发育表达强度逐渐减少；PTEN蛋白在0，4，8天组原始卵泡中均有表达，表达部位由卵母细胞胞浆转向颗粒细胞胞浆，随着卵泡的发育表达量逐渐减少。
　　 2.Pten-shRNA慢病毒感染后，最佳感染时间为卵巢取出后的36h，最佳感染复数MOI=1.0×109×20×10-3/1×106=20.用HE染色，RT-PCR和western blot法检测，与对照组相比，原始卵泡数占卵泡总数的比例降低，pten mRNA和PTEN蛋白表达量明显下降。Pten-shRNA慢病毒感染后的培养液中雌激素含量降低，孕激素显著降低。
　　 3.加入PI3K抑制剂LY294002后，与空白组相比，pten mRNA表达变化不明显，原始卵泡数占所有卵泡总数的比例升高，原始卵泡发育受抑制。Pten-shRNA慢病毒感染后，用western blot观察PTEN蛋白表达在8天正常组比0天正常组下降，8天最佳干扰组比8天正常组下降。PI3K蛋白表达在8天最佳干扰组比8天正常组下降。
　　 结论：
　　 1.Pten mRNA在原始卵泡中有表达，PTEN蛋白的表达量随着原始卵泡启动生长而降低。
　　 2.Pten-shRNA慢病毒转染后，原始卵泡数量减少，促进了原始卵泡的启动生长。
　　 3.抑癌基因pten通过PI3K信号通路对原始卵泡的发育起作用，其上下游关系可能是pten→PI3K；还可同时通过卵泡细胞分泌的孕激素对原始卵泡的发育起调控作用。