连翘酯苷A抗内毒素作用及作用机制的实验研究

摘要

目的:
　　观察连翘酯苷A(Forsythoside A，FA)对LPS诱导巨噬细胞(RAW264.7)12h后细胞生存率、TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α表达的影响及对内毒素血症急性肺损伤小鼠血浆ET和TNF-α水平、肺组织病理及TLR4、MyD88和NF-κB表达的变化，探讨连翘酯苷A抗内毒素作用及其可能机制。
　　方法:
　　1.连翘酯苷A对LPS作用的巨噬细胞TLR4信号通路的影响
　　1.1实验分组:实验共分6组，分别为control组，LPS组，连翘酯苷A高、中、低剂量组（FA1、FA2、FA3）及多黏菌素B组(PMB); control组:细胞常规培养;LPS组:加入100ng/ml LPS，常规培养12h; FA1、FA2、FA3和PMB组:分别加入FA320ug/ml、80ug/ml、20ug/ml及PMB10ug/ml预处理RAW264.7细胞2h后，再给予100ng/ml LPS，培养12h。
　　1.2各项指标的检测:①MTT法检测各组细胞存活率;②RT-PCR方法检测各组细胞中TLR4和MyD88mRNA的表达;③Western blot法检测各组细胞中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白的表达;④ELISA法检测各组细胞上清中TNF-α的含量。
　　2.连翘酯苷A对内毒素血症急性肺损伤小鼠的保护作用
　　2.1模型建立:采用腹腔注射内毒素(10mg/kg)建立内毒素血症急性肺损伤小鼠模型;
　　2.2实验分组:48只雄性SPF级BALB/C小鼠随机分成六组:正常对照组（A组）、急性肺损伤模型组（B组）、抗体组（C组）、连翘酯苷A高、中、低剂量组（D、E、F组）;其中连翘酯苷A干预组在造模前7天开始腹腔给药，每天一次，分别给予FA80mg/kg、20mg/kg和5mg/kg，抗体组在造模前12h前腹腔注射Anti-TLR4/MD2抗体50ug/20g。各组小鼠在造模4h后留取血和肺组织。
　　2.3各项指标的观察和检测:①动态浊度法检测血浆内毒素水平;②HE染色法观察小鼠病理组织学变化;③RT-PCR方法检测肺组织中TLR4mRNA的表达;④Western blot法检测肺组织TLR4蛋白的表达;⑤免疫组化法检测肺组织MyD88和NF-κB蛋白的表达;⑥ELISA法检测血清中TNF-α的表达;
　　结果:
　　1.连翘酯苷A对LPS作用的巨噬细胞TLR4信号通路的影响
　　1.1 MTT法检测结果:与control组比较，LPS(100ng/ml)组细胞存活率显著下降;FA1、FA2、FA3剂量预处理均能明显提高细胞存活率(P＜0.01)，并呈剂量依赖关系;FA1组与PMB组比较无显著性差异。
　　1.2 TLR4 mRNA和蛋白的表达:control组RAW264.7细胞只表达少量TLR4，给予LPS刺激12h，TLR4表达明显升高(P＜0.01)，FA1、FA2、FA3预处理均可明显降低TLR4的表达，并呈剂量依赖关系。
　　1.3 MyD88和NF-κB蛋白的表达:与control组比较，LPS组的表达明显上调(p＜0.01)，FA各剂量组均能不同程度减轻上述变化，以高剂量组作用最为明显。
　　1.4 TNF-α的水平:给予LPS刺激后，培养上清中TNF-α的含量表达明显升高(P＜0.01)，FA预处理均可降低TNF-α的分泌，并呈剂量依赖关系。
　　2连翘酯苷A对内毒素血症急性肺损伤小鼠的保护作用
　　2.1一般情况改变:造模后，小鼠出现精神萎靡，懒动，厌食，大小便失禁。FA各组用药后与模型组比较有明显改善。
　　2.2各项检测指标结果:与正常组相比，模型组血浆中内毒素含量显著升高(P＜0.01)，肺组织有明显的病理学损伤(P＜0.01)，肺组织TLR4、MyD88和NF-κB蛋白的表达明显上调(P＜0.01)，TLR4mRNA的变化与TLR4蛋白基本一致，血清中TNF-α的含量显著升高(P＜0.01); FA干预各组均能显著减轻上述指标变化，并呈剂量依赖关系。
　　结论:
　　连翘酯苷A预处理能提高LPS作用的巨噬细胞RAW264.7的生存率;腹腔给药对内毒素血症急性肺损伤小鼠起保护作用，从细胞和整体水平证实了连翘酯苷A具有抗内毒素作用，其机制可能与其抑制LPS-TLR4-MyD88-NF-κB信号通路有关。

目录

声明

摘要

主要英文缩略表

第1章 前言

第2章 连翘酯苷A对LPS作用的巨噬细胞TLR4信号通路的影响

2．1 实验材料

2．1．1 实验细胞及实验药物

2．1．2 实验仪器

2．1．3 实验试剂

2．2 实验方法

2．2．1 实验分组

2．2．2 细胞培养

2．2．3 主要溶液配制

2．2．4 MTT法(即四氮噻唑蓝比色法)

2．2．5 RT-PCR法

2．2．6 免疫印迹法测蛋白(Western blot测蛋白)

2．2．7 ELISA法测细胞上清中TNF-α的含量

2．2．8 统计方法

2．3 实验结果

2．3．1 各组细胞生存率的变化

2．3．2 各组细胞TLR4mRNA和蛋白表达的变化

2．3．3 各组细胞MyD88mRNA和蛋白表达的变化

2．3．4 各组细胞NF-κB蛋白表达的变化

2．3．5 各组细胞上清中TNF-α含量的检测结果

2．4 讨论

第3章 连翘酯苷A对内毒素血症急性肺损伤小鼠的保护作用

3．1 实验材料

3．1．1 实验动物及实验用药

3．1．2 主要实验仪器

3．1．3 主要实验试剂

3．2 实验方法

3．2．1 实验模型的建立及分组

3．2．2 实验观察

3．2．3 血液内毒素的含量检测方法

3．2．4 肺组织病理检测的方法(Hematoxylin-eosim，HE染色)

3．2．5 肺组织TLR4mRNA表达的检测(RT-PCR法，同2．2．5)

3．2．6 肺组织TLR4蛋白的检测(Western Blot法，同2．2．6)

3．2．7 肺组织免疫组化检测

3．2．8 血清中TNF-α含量的检测方法(方法同2．2．7)

3．2．9 统计方法(方法同2．2．8)

3．3 实验结果

3．3．1 小鼠造模后的一般表现情况

3．3．2 各组小鼠血浆内毒素含量的结果

3．3．3 各组小鼠肺组织病理学检测结果

3．3．4 各组小鼠肺组织TLR4mRNA和TLR4蛋白表达

3．3．5 肺组织免疫组化检测结果

3．3．6 各组小鼠血清中TNF-α的含量

3．4 讨论

第4章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述