萍乡红鲫卵母细胞组化及ZP(zona pellucida)基因的分子特征和表达分析

摘要

萍乡红鲫( Pingxiang red-transparent crucian carp, Carassius auratus var.Pingxiangnensis,简写CaP),分布于中国江西省萍乡地区,是一种自然野生的三倍体鲫鱼突变体,具有雌核发育和两性生殖两种方式。关于萍乡红鲫卵膜透明带基因(Zona Pellucida genes of CaP,CaP_ZP)表达和调控的研究很少。本研究包括以下四个部分:
　　一,应用细胞化学方法研究了萍乡红鲫卵子发生过程中主要生物大分子的变化。从1时相卵母细胞发育到2时相卵母细胞,可见蛋白质沉积。但过碘酸-雪夫反应(Periodic acid Schiff,PAS反应)和苏丹黑反应为阴性。随着卵母细胞的继续发育,糖类和脂类在卵母细胞质中出现。结果显示,成熟卵母细胞包含了大量蛋白质、糖类和脂类,为成功受精以及胚胎发育作好准备。
　　二,利用蔗糖-尿素法来分离纯化萍乡红鲫卵母细胞卵壳蛋白,SDS-PAGE胶分析显示位于40-70kDa的四条卵膜蛋白条带分子量大小与已经获得的萍乡红鲫CaP_ZP2和CaP_ZP3基因cDNA序列推导的氨基酸是相符的。利用RACE-PCR的方法,从萍乡红鲫卵巢组织中,克隆出了CaP_ZP2基因cDNA全长1682bp,包含了一个1584bp的开放阅读框,编码527个氨基酸残基。采用染色体步移方法,成簇的编码CaP_ZP蛋白的三个CaP_ZP基因被克隆鉴定出。这三个CaP_ZP基因,CaP_ZP3.1,CaP_ZP2和CaP_ZP3.2,位于一个10,855bp区域之内。这三个CaP_ZP基因都包含8个外显子和7个内含子,外显子长度分别为1348bp,1638bp和1348bp。这三个CaP_ZP基因的外显子和内含子的基因组结构是完全相同的,暗示这三个ZP基因可能来自共同的基因祖先。
　　三,本研究利用荧光定量PCR的方法,检测了萍乡红鲫CaP_ZP2基因mRNA在心脏,肝脏,脾脏,肾脏,大脑和卵巢组织中的差异性表达。结果表明:CaP_ZP2基因在肝脏中的表达量最低,卵巢组织中的表达量最高。卵巢中CaP_ZP2基因的表达水平大约是肝脏中的85,932倍。其他组织中,CaP_ZP2基因仅有微量的表达。利用荧光定量PCR技术,进一步检测了CaP_ZP2和CaP_ZP3基因mRNA在卵巢组织不同发育阶段中差异性表达。分析结果显示,两个CaP_ZP基因在4-8月龄早期发育的卵巢中表达水平较高,在9-12月龄晚期的卵巢中,表达水平急剧降低。原位杂交实验也证实CaP_ZP2基因在卵母细胞发育的早期检测到较强的杂交信号,发育晚期杂交信号减弱。在卵巢发育的不同时期,这两个基因具有相同的表达模式。
　　四、一段特殊的1097bp启动子序列被克隆,该序列是CaP_ZP2和CaP_ZP3.2基因的共用启动子序列。将该启动子序列从顺反方向上插入到修饰的pAcGFP1-1载体中。质粒瞬时转染cos-7细胞系。在cos-7细胞中观察到较强的GFP荧光信号。由此,我们鉴定出了一段特殊的启动子序列,该序列利用顺反方向上相同的调控元件,启动了CaP_ZP2和CaP_ZP3.2基因的表达。

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第一章 文献综述

1.1 鱼类与其它动物受精生物学

1.2 透明带 (zona pellucida) ZP基因研究概况

1.3 本研究的内容、目的及意义

第二章 萍乡红鲫卵母细胞中蛋白、糖类和脂肪的组化分析

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

第三章 萍乡红鲫ZP基因克隆及其基因组结构分析

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

第四章 萍乡红鲫ZP基因表达模式及其启动子活性分析

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3结果

4.4 讨论

参考文献

致谢

攻读学位期间的研究成果