绿原酸对氧化应激损伤人视网膜色素上皮细胞保护作用的分子机制

摘要

目的:
　　观察绿原酸(CGA)对过氧化氢诱导的氧化应激损伤人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)的保护作用,通过观察视网膜色素上皮细胞在过氧化氢处理后细胞凋亡相关分子的表达变化,探讨绿原酸对氧化应激的视网膜色素上皮细胞的抗凋亡作用及其可能的分子机制,为将来临床上利用绿原酸治疗年龄相关性黄斑变性等与氧化应激相关的眼病提供理论依据。
　　方法:
　　1、参考国外相关文献,以500uM浓度的过氧化氢(H2O2)作用于ARPE-19人视网膜色素上皮细胞24h,建立氧化应激损伤模型。
　　2、WST-1细胞增殖实验检测绿原酸对ARPE-19人视网膜色素上皮细胞的毒性,绿原酸处理细胞24h后待检。
　　3、实验分三组:正常对照组,过氧化氢建模组,绿原酸保护组。WST-1细胞增殖实验检测各组细胞存活率。
　　4、采用流式细胞仪检测每个实验组ARPE-19细胞的凋亡率。
　　5、通过RT-PCR检测每个实验组细胞的Bcl-2和Caspase-3基因表达水平。
　　6、通过Western blot检测每个实验组细胞的Bcl-2和Caspase-3蛋白表达水平。
　　结果:
　　1、不同浓度的CGA(12.5uM,25uM,50uM,100uM,200uM)处理ARPE-19人视网膜色素上皮细胞24 h后,各实验组ARPE-19细胞的相对细胞活力(cell viability)与对照组相比差异无统计学意义;说明0~200uM浓度的CGA对ARPE-19人视网膜色素上皮细胞没有表现出明显的毒性作用。
　　2、各实验组的相对细胞活力 H2O2建模组低于对照组( P<0.05),50uM,100uM,200uM的CGA保护组高于H2O2建模组(P<0.05);说明H2O2能够诱导ARPE-19人视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤,而CGA具有保护过氧化氢诱导的ARPE-19人视网膜色素上皮细胞的氧化应激损伤的作用。
　　3、各实验组细胞凋亡率(％)正常对照组为8.31±2.87, H2O2建模组为65.43±8.82,绿原酸(100uM)保护组为29.43±6.80。结果显示建模组的细胞凋亡率高于正常对照组的凋亡率(P<0.05),绿原酸保护组的细胞凋亡率低于H2O2建模组的凋亡率(P<0.05);说明H2O2能够诱导ARPE-19人视网膜色素上皮细胞凋亡,绿原酸具有抗ARPE-19人视网膜色素上皮细胞凋亡作用。
　　4、RT-PCR结果显示 Bcl-2mRNA表达水平H2O2建模组低于正常对照组而绿原酸保护组高于H2O2建模组(P<0.05),Caspase-3mRNA表达水平H2O2建模组高于正常对照组而绿原酸保护组低于H2O2建模组(P<0.05);说明绿原酸保护过氧化氢诱导的ARPE-19人视网膜色素上皮细胞的氧化应激损伤时上调Bcl-2基因的表达,下调Caspase-3基因的表达。
　　5、Western blot结果显示 Bcl-2蛋白表达水平H2O2建模组低于正常对照组而绿原酸保护组高于H2O2建模组(P<0.05),Caspase-3蛋白表达水平H2O2建模组高于正常对照组而绿原酸保护组低于H2O2建模组(P<0.05);说明绿原酸保护过氧化氢诱导的ARPE-19人视网膜色素上皮细胞的氧化应激损伤时上调Bcl-2蛋白的表达,下调Caspase-3蛋白的表达。
　　结论:
　　1、绿原酸对氧化应激损伤的ARPE-19人视网膜色素上皮细胞具有保护作用,而对正常的ARPE-19细胞没有表现出明显的毒性作用。
　　2、绿原酸对H2O2诱导的氧化应激损伤ARPE-19人视网膜色素上皮细胞具有抗凋亡保护作用,其可能通过增强Bcl-2基因和蛋白表达以及抑制Caspase-3的基因和蛋白发挥保护作用。

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中英文缩略词

第1章 前言

第2章 材料与方法

2.1 主要实验设备

2.2 实验材料

2.3 主要试剂

2.4 主要溶液及试剂配制

2.5 实验方法

第3章 实验结果

3.1 绿原酸对ARPE-19细胞毒性的影响

3.2 绿原酸对氧化应激损伤ARPE-19细胞活力的影响

3.3 采用流式细胞仪检测每个实验组ARPE-19细胞的凋亡率

3.4 通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测每个实验组细胞的Bcl-2和Caspase-3基因表达水平

3.5 通过蛋白印记法（Western blot）检测每个实验组细胞的Bcl-2和Caspase-3蛋白表达水平

第4章 讨论

4.1 年龄相关性黄斑变性

4.2 氧化应激与细胞凋亡

4.3 ARPE-19细胞氧化应激损伤模型的建立

4.4 绿原酸对氧化应激损伤人视网膜色素上皮ARPE-19细胞的保护作用及机制

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述