ANXA10对人原发性肝癌细胞株(HepG2)中的VEGFA、AKT3、PIK3CA基因表达影响的研究

摘要

目的:
　　1、构建携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)的人膜联蛋白A10基因(ANXA10)过表达慢病毒,然后转染人肝癌细胞株HepG2。
　　2、采用转录组测序的方法检测ANXA10过表达慢病毒对HepG2基因表达谱所产生的影响,初步阐明ANXA10对HepG2生物学行为的影响、可能涉及的基因及相关的信号通路,为原发性肝癌形成中的ANXA10作用的深入研究奠定基础。
　　方法:
　　构建携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)的人膜联蛋白A10基因(ANXA10)过表达慢病毒LV-ANXA10,体外培养的HepG2分为三组:实验组、空载体对照组和空白对照组,各组分别转染LV-ANXA10、慢病毒空载体以及等量的Polybrene(病毒及空载体以MOI=10浓度转染),转染72小时后使用荧光倒置显微镜观察增强绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况,从而来确定ANXA10的转染效率,转染后96小时和120小时分别提取三组细胞的RNA行转录组测序比较三组细胞相同时间点及同组细胞不同时间点基因表达谱的差异,并采用qPCR验证部分差异表达基因。
　　结果:
　　1、ANXA10过表达慢病毒能影响HepG2的基因表达谱。通过对转录组信息的分析,发现在转染后96小时的空白对照组与实验组比较发生显著转录差异的基因有69个,其中26个基因上调,43个基因下调;空载体对照组与实验组相比发生显著转录差异的基因有53个,其中25个基因上调,28个基因下调;空载体对照组与空白对照组比较发生显著转录差异的基因有12个,其中8个基因上调,4个基因下调。而在转染后120小时的空白对照组与实验组的比较中发生显著转录差异的基因有742个,其中110个基因上调,632个基因下调;空载体对照组与实验组的比较中发生显著转录差异的基因有313个,其中168个基因上调,145个基因下调;空载体对照组与空白对照组比较发生显著转录差异的基因有36个,其中24个基因上调,12个基因下调。进一步研究发现在转染96小时及120小时,实验组与空载体对照组及空白对照组比较VEGFA、AKT3、PIK3CA的表达均是下调的,而空载体对照组与空白对照组比较无上述变化。
　　2、采用荧光定量PCR技术验证,其结果表明,两个时间点的实验组与空载体对照组及空白对照组三组比较,实验组中VEGFA、AKT3、PIK3CAmRNA表达明显下调,差异有统计学意义(P<0.05),但空载体对照组与空白对照组相比较无明显差异(P>0.05),与转录组测序的分析结果吻合,从而证实VEGFA、AKT3、PIK3CA在转染过表达慢病毒ANXA10的HepG2细胞和转染空载慢病毒的HepG2细胞及HepG2细胞的表达的差异性。
　　结论:
　　1、ANXA10过表达对HepG2基因表达谱有影响。
　　2、ANXA10过表达对人肝癌相关的细胞因子VEGFA、AKT3、PIK3CA可能存在抑制效应。

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中英文缩略词表

第1章 前言

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 统计学分析

第3章 结果

3.1 重组慢病毒转染效率检测

3.2 转录组测序的结果3.2.1 RNA质量控制结果

3.3 荧光定量PCR实验结果

3.4 差异基因的GO分析及Pathway分析

第4章 讨论

4.1 转录组测序

4.2 膜联蛋白A10

4.3 肝癌发病的相关因子

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述

1 ANXA1与肝癌

2 ANXA2与肝癌

3 ANXA3与肝癌

4 ANXA4与肝癌

5 ANXA10与肝癌

6 其它一些与肝癌发病有关的因子

7 结语