PLIγ重组表达载体构建及其抗LPS诱导的THP-1细胞炎症作用

摘要

分泌型磷脂酶A2(Secretory Phospholipase A2,sPLA2)是花生四烯酸(AA)代谢通路的上游关键酶,sPLA2的激活导致AA水平升高,进而产生更多的炎症介质,例如前列腺素、白三烯、血栓烷A等。因此,sPLA2的高表达可导致多种炎性疾病,例如胰腺炎、风湿性关节炎、肿瘤、动脉粥样硬化等, sPLA2也是以上多种疾病药物治疗的重要靶点。
　　自然界中sPLA2在蛇毒中分泌最为广泛,蛇毒中毒患者也常有全身炎症反应综合症(SIRS)和组织坏死的症状。我们实验室前期从华游蛇(Sinonatrix annularis)—一种中国的无毒蛇中,分离到蛇毒sPLA2(svPLA2)的γ型抑制蛋白(phospholipae A2 inhibitor, PLIγ)。前期研究中,我们发现这种PLIγ有良好的抗蛇毒PLA2出血毒作用。此外,与蛇毒PLA2与人sPLA2结构高度相似,分类上属于相同的亚型。因此,PLIγ能否阻断人类sPLA2,并可能对花生四烯酸(AA)介导的炎症发挥抑制作用,这个问题引起了我们的研究兴趣。鉴于此,我们克隆了PLIγ基因,并将其导入THP-1细胞中,评价PLIγ对LPS诱导的人THP-1细胞炎症的作用。
　　目的:
　　为了研究体内PLIγ在细胞水平的抗炎症作用,我们构建PLIγ重组表达载体并转染人THP-1细胞,检测细胞中sPLA2亚型,从而阐明其与炎症反应相关的sPLA2亚型,同时检测一些典型的促炎因子如AA、TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、PAF表达水平,通过LPS诱导的THP-1细胞,探讨PLIγ的抗炎活性。
　　方法:
　　设计分别含有EcoRI,BamHI酶切位点的上下游引物,通过RT-PCR克隆华游蛇PLIγ基因。PCR产物和pIRES2-EGFP载体经过酶切、凝胶回收和T4酶连接,构建pIRES2-EGFP-PLIγ重组表达载体,将其转化入DH5α菌保存,通过EcoRI,BamHI双酶切鉴定重组载体。重组载体通过脂质体法转染人THP-1细胞,于显微镜下观察GFP绿色荧光的表达,评价转染效率。
　　由于转染效率较低,且重组质粒在THP-1细胞有丝分裂过程中容易丢失,因此,该质粒不适合后续的功能试验。为了保证PLIγ在THP-1的稳定表达,我们转而采用慢病毒载体系统。我们将PLIγ基因与含有3个Flag序列的标签融合表达,生成慢病毒载体PGC-FU-PLIγ-EGFP。将该重组病毒载体转染293T细胞,获得有感染能力的重组慢病毒LV-PLIγ-EGFP。重组蛋白PLIγ-3Flag的表达情况由western blot检测。
　　将病毒LV-PLIγ-EGFP感染THP-1细胞,通过GFP荧光率评价感染效率。THP-1细胞分为三组:正常细胞组(control组)、PLIγ阴性组(该组仅转染LV-EGFP,也称 mock组)、PLIγ阳性组(该组转染 LV-PLIγ-EGFP,也称 PLIγ组)。实验时,将1μg/ml LPS孵育各组THP-1细胞,同时设置与各组相对应的不加LPS的平行组。Real-time PCR方法检测各组细胞中sPLA2各亚型,采用ELISA法检测AA、TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、PAF等炎症因子表达水平,WST-1法研究各组THP-1细胞的增殖。
　　结果:
　　成功构建了pIRES2-EGFP-PLIγ的真核表达质粒,但由于该质粒的转染效率和稳定性都较低,不能满足后续功能试验要求。通过荧光显微镜观察和Western blot检测,本文构建的慢病毒系统能高效、稳定地表达GFP绿色荧光和PLIγ。
　　在LPS诱导THP-1细胞炎症过程中,我们发现两种sPLA2亚型(IIF和X)及六种炎症因子表达显著上调。相对于正常组THP-1细胞,病毒转染组(PLIγ组和mock组)细胞炎症因子表达量更高。更重要的是,PLIγ组相对于mock组,其六种炎症因子的表达水平更低。WST-1实验发现,相对于正常组THP-1细胞,病毒转染组(PLIγ组和mock组)细胞增殖速度略慢,不过PLIγ组相对于mock组细胞增殖速度略快。
　　结论:
　　重组慢病毒系统可以稳定、高效地表达异源基因,如本文中的PLIγ基因。PLIγ的存在可以显著降低AA、TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、PAF等六种炎症因子表达。由于IIF和X型sPLA2在LPS诱导的THP-1细胞中表达上调,说明PLIγ很可能是通过抑制这两种sPLA2的激活而发挥抗炎症作用。此外,PLIγ不会影响细胞的增殖。

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第1章 引言

1.sPLA2与炎症

2. PLIγ与抗炎

3.本文研究目的

第2章华游蛇PLIγ真核表达载体构建及细胞转染

1.材料、试剂和仪器

2.实验方法

3结果与分析

4小结与讨论

第3章 慢病毒重组载体PGC-FU-PLIγ-EGFP的构建及病毒感染THP-1细胞

1材料试剂和仪器

2实验方法

3结果与分析

4.讨论

第4章 PLIγ抑制LPS诱导的THP-1细胞炎症作用

1.材料试剂和仪器

2.实验方法

3.结果与分析

4.讨论

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述