藻酸锶凝胶的理化性质及其复合兔骨髓间充质干细胞体外三维培养的实验研究

摘要

目的:研究新型藻酸锶凝胶(Alg-Sr)的理化性质,观察并检测兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)于藻酸锶凝胶(Alg-Sr)中的存活、增殖及成骨分化情况,为复合 BMSCs的 Alg-Sr应用于骨的再生及修复提供理论依据。
　　方法:(1)制备0.2mol/L的氯化锶胶凝液(SrCl2),将其与2.0wt％的藻酸钠溶液交联形成 Alg-Sr,肉眼观察其大体形态,扫描电镜(SEM)观察其微观结构并测量其压缩模量、降解率及溶胀率,并将其与同样方法及浓度制备的藻酸钙凝胶(Alg-Ca)对比。
　　(2)全骨髓法获取兔 BMSCs,体外扩增培养并行免疫细胞化学法鉴定;
　　(3)将第5代兔 BMSCs以细胞密度为5105/ml接种于 Alg-Sr中行三维培养,每日观察凝胶中细胞的生长形态,行 Live/Dead细胞染色测定细胞活力,DNA定量分析细胞的增殖情况,并设 BMSCs接种于 Alg-Ca中以同样方法培养作为对照组。
　　(4)BMSCs分别接种于 Alg-Sr和 Alg-Ca中成骨诱导后,通过检测细胞分泌的 ALP活性,荧光定量 PCR检测成骨相关基因 OSX、Collagen I、Runx2的 mRNA表达情况,茜素红及冯库染色检测钙盐沉积情况。
　　结果:(1)大体观察上来看,Alg-Sr和 Alg-Ca均为直径约3mm的白色透明凝胶珠,将它们浸入培养基中数分钟后凝胶均呈橙黄色;SEM观察发现 Alg-Sr与 Alg-Ca均形成典型的“鸡蛋盒”样结构,孔隙大小均匀;测得 Alg-Sr的压缩模量为(186.53±8.37)kPa,大于 Alg-Ca的(152.14±7.45)kPa,差异有统计学意义(t=6.863,P<0.05);Alg-Sr与 Alg-Ca的体外降解率于前20天无统计学差异(P>0.05),第20、25、30天,Alg-Sr的降解率显著低于 Alg-Ca(P<0.05);Alg-Sr和 Alg-Ca的溶胀率分别为14.32%±1.53%和15.25%±1.64%,两者间差异无统计学意义(t=0.927,P>0.05)。
　　(2)通过全骨髓培养法及换液、传代,并通过细胞形态及免疫细胞荧光鉴定结果 CD29(+)、CD34、CD44(+)、CD45表明成功获得兔 BMSCs。
　　(3)兔 BMSCs于 Alg-Sr和 Alg-Ca中三维培养时细胞生长形态和增殖趋势均相似,接种初期(1~4天)细胞悬浮于凝胶内成圆球形散在分布,约4天后细胞逐渐黏附于凝胶内壁呈星形或多角形生长,并逐渐形成大量细胞集落;兔 BMSCs于 Alg-Sr中三维培养21天时 DNA含量为(4.38±0.24)g,显著高于 Alg-Ca中的(3.25±0.21)g,(t=7.923,P<0.05)。
　　(4)BMSCs于 Alg-Sr和 Alg-Ca两种凝胶中成骨诱导12天后,Alg-Sr中 ALP活性为(2.14±0.11)金氏单位/100 mL,Alg-Ca中为(1.69±0.14)金氏单位/100 mL(t=5.652,P<0.05),差异有统计学意义(t=5.652,P<0.05);Alg-Sr中的细胞表达的 OSX、Collagen I、Runx2的 mRNA相对表达量均显著高于 Alg-Ca组(P<0.05);Alg-Sr来源的 BMSCs成骨诱导21天后行茜素红染色及冯库染色后,其钙结节数量和磷酸盐沉积面积均高于 Alg-Ca来源的细胞组,差异有统计学意义(P<0.05)。
　　结论:Alg-Sr与 Alg-Ca有相似的均匀孔隙结构,BMSCs适合在其内三维培养。但相对于 Alg-Ca,Alg-Sr具有更强的机械强度和更低的降解率,此外,其对 BMSCs的增殖及成骨分化能力具有更显著的促进作用。因此,与 Alg-Ca相比,Alg-Sr是一种新型的优良的骨再生及修复的细胞支架材料。

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英文缩略词表

引 言

1 种子细胞

2 细胞支架材料

3 成骨因子

第一部分 Alg-Sr 凝胶的制备及理化性质表征

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 附图

第二部分 兔 BMSCs 的分离、培养及鉴定

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 附图

第三部分 兔 BMSCs 接种于 Alg-Sr 凝胶中的生长及增殖

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 附图

第四部分 兔 BMSC 于 Alg-Sr 凝胶中成骨分化的研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 附图

全文结论

不足与展望

致谢

参考文献

在学期间发表论文

综 述