KPNA2过表达促进rtA181T突变型乙肝病毒表面蛋白入核上调肝细胞c-Myc表达

摘要

目的：
　　构建p-KPNA2、p-HBsAg、p-HBsAgt三种质粒，通过分组分别转染HepG2细胞、LO2细胞和293T细胞，探讨KPNA2过表达在rtA181T型乙肝病毒表面蛋白上调c-Myc表达过程中的作用。
　　方法：
　　（1）从GenBank中分别查找KPNA2、HBsAg的mRNA序列，利用primer premier5.0软件设计引物，应用RT-PCR方法获得目的片段，双酶切后与真核表达质粒连接，从而构建成p-KPNA2、p-HBsAg质粒；（2）以构建好的p-HBsAg质粒为模板，采用定点突变方法使其产生rtA181T突变以构建p-HBsAgt质粒；（3）分组与转染：①p-HBsAg组、②p-HBsAgt组、③p-KPNA2组、④p-KPNA2+p-HBsAg组、⑤p-KPNA2+p-HBsAgt组、⑥空载质粒组，共6组；分别转染HepG2细胞、LO2细胞、293T细胞；（4）检测：转染48h后，采用Ligand绿色荧光染料染色技术检测KPNA2的细胞内分布；收集细胞总蛋白，western blot检测目的蛋白的表达并进行灰度值分析；收集细胞总RNA，RTFQ-PCR检测目的基因mRNA的表达。
　　结果：
　　（1）质粒双酶切后用1％琼脂糖凝胶电泳检测，条带位置大小与目的片段一致；（2）p-KPNA2、p-HBsAg和p-HBsAgt重组质粒测序结果符合实验要求；（3）三种质粒转染HepG2细胞后，western blot检测结果显示，p-KPNA2+p-HBsAgt组和p-HBsAgt组的c-Myc表达都显著高于其他4组（P＜0.05），说明 rtA181T型乙肝病毒表面蛋白能够上调 c-Myc表达；但p-KPNA2+p-HBsAgt组与p-HBsAgt组比较无明显差异（P＞0.05）。（4）三种质粒转染LO2细胞后，western blot检测结果显示，p-KPNA2+p-HBsAgt组和p-HBsAgt组的c-Myc表达也显著高于其他4组（P＜0.05），且p-KPNA2+p-HBsAgt组明显高于p-HBsAgt组（P＜0.05），说明KPNA2过表达能够促进rtA181T型乙肝病毒表面蛋白上调LO2细胞中的c-Myc表达；（5）三种质粒转染293T细胞后，western blot检测结果显示，6组细胞的c-Myc表达水平无明显差异（P＞0.05）；（6） RTFQ-PCR结果显示，在LO2细胞中，p-KPNA2+p-HBsAgt组和p-HBsAgt组c-Myc的mRNA表达高于p-HBsAg组（P＜0.05），与结果（4）存在一致性。
　　结论：
　　KPNA2过表达能促进rtA181T型乙肝病毒表面蛋白上调正常肝细胞中的c-Myc表达。rtA181T型突变是慢性乙型肝炎拉米夫定和阿德福韦酯治疗中常见的耐药突变，且裸鼠皮下注射该突变株能够引起肿瘤形成。为防治耐拉米夫定和阿德福韦酯的突变所致的肝细胞癌，KPNA2值得进一步研究。

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中英文对照词表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 实验主要试剂和材料

2.2实验主要设备和仪器

2.3 实验主要试剂的配制

2.4 pFC14A-KPNA2质粒的构建

2.5 pcDNA3.1-HBsAg质粒的构建

2.6 pcDNA3.1-HBsAgt质粒的构建

2.7 pFC14A-KPNA2质粒转染HepG2细胞

2.8 pcDNA3.1-HBsAg质粒转染HepG2细胞

2.9 HepG2细胞免疫荧光实验

2.10 p-KPNA2、p-HBsAg 、p-HBsAgt三种质粒的共转染

2.11 western blot检测HepG2、LO2和293T细胞内c-Myc表达水平

2.12 RTFQ-PCR检测LO2细胞中c-Myc的mRNA表达水平

2.13 数据处理

第3章 结果

3.1 成功构建pFC14A-KPNA2质粒

3.2 成功构建pcDNA3.1-HBsAg质粒

3.3 成功构建pcDNA3.1-HBsAgt质粒

3.4 pFC14A-KPNA2质粒转染HepG2细胞

3.5 pcDNA3.1-HBsAg质粒转染HepG2细胞

3.6 c-Myc在HepG2细胞中的表达水平

3.7 c-Myc在LO2细胞中的表达水平

3.8 c-Myc在293T细胞中的表达水平

3.9 LO2细胞中p-HBsAg组、p-HBsAgt组和p-HBsAgt+p-KPNA2组的c-Myc的mRNA表达水平

3.10 p-HBsAgt对不同细胞中c-Myc的表达影响

第4章 讨论

第5章 结 论

致谢

参考文献

综述: 核质转运受体KPNA2与癌症的相关研究进展