钙通道CACNA1C基因突变致心原性猝死相关早期复极的分子遗传学机制探讨

摘要

心原性猝死（sudden cardiac death, SCD）是人类健康头号杀手心血管疾病导致的突发性自然死亡。在诸多SCD高发的心血管疾病中，具有极高风险尤其对年轻人造成危害的遗传性心律失常综合征日渐受到关注。主要由各种离子通道蛋白及其调控蛋白编码基因突变导致的遗传性心律失常综合征通常不伴心脏结构功能异常，而呈现以各种特征性的心电图形态，在特殊环境状态下诱发严重的心电生理活动紊乱促使恶性心律失常发生，从而导致SCD。
　　早期复极（early repolarization, ER）是部分心肌提前复极形成心电图上J点抬高和非心肌缺血性ST段抬高的特殊波形，在人群中广泛存在，且在半个世纪以来被认为是一种正常的心电图表现。随着流行病学调查研究的大力开展，部分有ER表现的人群被发现存在SCD风险及家族聚集现象。如何辨别具有SCD风险的ER表现成为临床医生所面临的棘手问题。在最新的遗传性心律失常综合征诊治共识中，这类具有恶性心律失常病史或SCD家族史且心脏结构正常，≧2个连续下壁和/或侧壁导联出现J点抬高≧1 mm心电图表现的一组临床症候群被定义为早期复极综合征（earl repolarization syndrome, ERS）。
　　近年来分子遗传学理论和技术的飞速发展极大地推动了人们对遗传性心律失常综合征中各类疾病的认知与探索。编码 ATP敏感性钾离子通道 Kir6.1的KCNJ8和 ABCC9基因，编码 L型钙离子通道的 CACNA1C、CACNB2b和CACNA2D1基因，以及编码钠离子通道的SCN5A基因突变相继在ERS中报道。突变导致的外向钾离子通道功能增强和内向钙离子或钠离子通道功能减弱被认为是ERS的病理性致病基础。ER不同于长QT综合征和Brugada综合征等其它具有显著遗传学特性的遗传性心律失常综合征类型，ERS致病基因突变多见于散发病例，具有家族遗传性的基因突变罕见。此外，国人ERS的遗传学研究报道罕见，由此可见国人相关致病基因突变的研究仍存在很大空间，对有明显症状或猝死家族史的家系进行级联式遗传学筛查才能高效地筛查致病基因突变，并探索ERS分子遗传学发病机制，从而寻找更加有效的ERS个体化治疗方案。
　　第一部分心原性猝死大家系临床分析及遗传学检测
　　目的：
　　本研究通过对所收集的 SCD大家系先证者及存活成员进行全面的临床评估，并对先证者尸检报告仔细分析以及家系成员SCD候选基因筛查检测，解析该家系SCD发生机制，以异常心电图表现为线索寻找潜在的致死性原因及致病基因突变，为该家系SCD高危成员提供诊疗建议。
　　方法：
　　1.临床资料收集：严格遵循医学伦理准则，经医院伦理委员会审批获准及入选研究对象知情同意，对我院心内科就诊的江西籍SCD高危患者及其亲属临床资料进行采集。诊断标准参考2013年由美国心律协会（Heart Rhythm Society, HRS）、欧洲心律学会（European Heart Rhythm Association, EHRA）和亚太心律协会（Asia Pacific Heart Rhythm Society, APHRS）共同制定的遗传性心律失常综合征患者诊断和治疗专家共识，获取家系成员病史，心电图和心脏彩超等检查信息。
　　2.尸检资料收集：在SCD死者法定代理人知情同意的情况下，获取死者经司法机构提供的尸检报告及相关病理组织。
　　3.先证者心肌组织 HE染色：取死者心肌不同部位组织块制作切片并 HE染色，观察心肌组织结构形态。
　　4.遗传学检测：经患者及其家属知情同意后，采集外周静脉全血5 ml储存于EDTA真空抗凝管，采用血液基因组DNA提取试剂盒抽提外周血白细胞全基因组DNA，选择常见的遗传性心律失常综合征致病基因作为候选基因，包括编码钠离子通道的SCN5A、SCN1B、SCN3B和GPA1L基因，编码钾离子通道的KCNQ1、KCNH2、KCNJ8、KCNE1、KCNE2和 KCND3基因，编码钙离子通道的CACNA1C、CACNB2b和CACNA2D1基因以及编码通道调节蛋白的ANK2和PRKAG2基因，设计相应引物，使所测范围涵盖待测基因所有外显子以及外显子与内含子交界区序列，采用DNA直接测序法（双脱氧链终止法）进行测序筛查基因变异，随机选取本实验室DNA库中400例相同遗传背景及年龄性别匹配的正常健康人群标本作为对照，以发现新的致病基因突变位点或单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms, SNPs）。
　　5.统计学分析：所有涉及统计的实验数据均采用SPSS19.0软件包统计学分析软件进行分析。计量资料以均数±标准误（-x±s）表示，两组间比较采用 t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P值＜0.05具有统计学意义，P值＜0.01具有显著统计学意义。
　　结果：
　　1.本研究收集到一个原因不明夜间猝死大家系，死者为包含先证者在内的5名男性成员，先后在睡眠中发生猝死，均处青壮年时期，最小23岁，最大49岁，平均年龄34±8.4岁。
　　2.先证者尸检报告提示无机械性损伤、机械性窒息致死的法医病理学改变，也无中毒致死的依据；组织病理学检查结果排外各主要器官器质性病变，考虑猝死可能由心原性因素所致。所取心肌组织形态结构及排列均正常，可排外心肌病等各种结构性心脏病以及可伴右室心肌病变的Brugada综合征。先证者死前3年内偶发头晕、心悸，无胸闷、胸痛及晕厥；既往心脏彩超检查无明显异常，24小时3导联动态心电图记录II导联和aVF导联J点抬高≧1.5mm。
　　3.其他家庭成员既往史及个人史无特殊，无阳性体征，静息心电图、心脏彩超及平板运动试验检查未见明显异常。24 h动态心电图检查发现3位家庭成员有ER表现。其中先证者弟弟ER表现最为显著，下壁II、III和aVF导联，胸前V3~V5导联J点抬高0.05 mV~0.3 mV，且可见J波，V2~V4导联T波高尖。先证者儿子及其弟弟女儿的动态心电图表现为下壁和侧壁导联ST段抬高。
　　4.通过候选基因测序筛查发现该家系1个钙离子通道α1亚单位编码基因CACNA1C的杂合错义突变，由第48号外显子上第5747号碱基A转换为碱基G，导致第1916位谷氨酰胺变为精氨酸，即p.Q1916R。该突变见于先证者及源于父系的所有一级和二级亲属，而其母亲及母亲的兄弟姐妹和其他与先证者无血缘关系的家庭成员均不存在此突变。此外，在家系中还筛查到已被报道的5个CACNA1C基因SNPs，分别为c.2436C>T（p.D812D），c.3786C>T（p.F1262F）， c.5361G>A（p.T1787T），c.5609C>T（p.T1870M）和 c.5649G>A（p.P1883P），以及1个SCN5A基因SNPs，c.3578G>A（p.R1193Q）。
　　5. CACNA1C-Q1916R突变携带者中有ER表现和无ER表现成员心电图参数比较结果显示，有ER表现成员的心率校正QT间期比无ER表现的成员短，但均在正常范围，QT间期离散度（QT dispersion，QTd）和Tp-Te间期离散度（Tp-Te dispersion，Tp-ed）则更大，但两组间各参数差异无统计学意义。
　　结论：
　　1.本研究从一个青壮年男性SCD高发大家系，揭示SCD可能与ERS相关。
　　2. ERS致病基因CACNA1C-Q1916R新突变可能与该家系ERS致SCD相关。
　　3. CACNA1C-Q1916R突变携带家庭成员中 ER呈不完全外显性，考虑与SCN5A-R1193Q和性别相关。
　　4. ER家庭成员心电图中有致恶性心律失常性作用的复极化跨壁离散度参数指标QTd和Tp-ed增大，但与无ER表现的CACNA1C突变携带成员比较无统计学差异，样本量有限是可能原因。
　　5.其它所发现的CACNA1C基因SNPs（D812D、F1262F、T1787T、T1870M和P1883P）无明显致SCD效应。
　　第二部分 CACNA1C基因突变致心原性猝死相关ER的分子遗传学、细胞电生理机制及药物干预探讨
　　目的：
　　从组织和细胞水平探讨CACNA1C-Q1916R突变的功能变化及致SCD相关ER的分子机理，并筛选有效的治疗药物。
　　方法：
　　1.人心肌组织标本免疫组化：取携带CACNA1C基因突变先证者左心室肌组织，通过免疫组化法对组织内由CACNA1C基因翻译的Cav1.2蛋白表达及定位进行检测，并以成年人正常左心室标本作为对照。
　　2. CACNA1C-Q1916R定点突变：采用经典的定点突变技术，将CACAN1C基因第5747位碱基A突变为碱基G，进行测序验证并排除其它位点突变。
　　3. CACNA1C质粒瞬时转染：采用Lipofectamine2000转染试剂盒，将携带野生和突变型CACNA1C，以及野生型CACNB2b和CACNA2D1基因的质粒载体按摩尔浓度1:1:1分两组共转染入人胚肾293细胞（human embryonic kidney293, HEK293）中用于后续实验，用于膜片钳细胞电生理实验的细胞则按0.3比例额外转染表达绿色荧光的pEGFP-N3质粒。
　　4.实时荧光定量 PCR（ Quantitative Real time PCR, qRT-PCR）：采用qRT-PCR引物扩增表达野生和突变型CACNA1C的HEK293细胞中 CACNA1C的序列片段，检测突变对Cav1.2总mRNA表达的影响。
　　5.蛋白免疫印迹（Western Blot）：采用Western Blot检测表达野生和突变型CACNA1C的HEK293细胞中，Cav1.2在细胞总蛋白、膜蛋白和浆蛋白各水平的表达情况。
　　6.细胞免疫荧光：在共聚焦荧光显微镜下观察转染野生和突变型CACNA1C并经Cav1.2特异抗体荧光染色的HEK293细胞，检测突变对Cav1.2表达定位及转运的影响。
　　7.全细胞膜片钳细胞电生理分析及药物筛选：采用全细胞膜片钳技术记录表达突变型CACNA1C的HEK293细胞上L型钙离子流变化，以及雄激素睾酮（10μM）对其的影响。再分别加入ER治疗药物异丙肾上腺素（10μM）和奎尼丁（5μM），观察药物对钙离子流的影响，绘制电流-电压（I-V）曲线，电压依赖的稳态激活曲线(steady state activation, SSA)和电压依赖的稳态失活曲线(steady state inactivation, SSI)。
　　8.统计学分析：所有涉及统计的实验数据均采用SPSS19.0软件包统计学分析软件进行分析。计量资料以均数±标准误（-x±s）表示，两组间比较采用 t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P值＜0.05具有统计学意义，P值＜0.01具有显著统计学意义。
　　结果：
　　1.成功诱导CACNA1C-Q1916R突变，经测序验证CACAN1C基因第5747位碱基A突变为碱基G，其它位点未发生突变。
　　2.免疫组化结果显示携带CACNA1C基因突变的先证者心室肌组织Cav1.2蛋白表达水平低于正常对照组织（*P＜0.05），异源性表达突变Cav1.2的总mRNA表达水平较野生型Cav1.2低（*P＜0.01），且在细胞总蛋白、模蛋白和浆蛋白各水平的表达均下降（*P＜0.05）。
　　3.细胞免疫荧光结果显示突变型Cav1.2蛋白转运功能正常，但整体荧光强度更弱。
　　4.全细胞膜片钳结果显示突变组钙电流密度较野生组显著降低，降低有统计学意义（*P＜0.05，**P＜0.01），SSA和SSI两组间无差异；睾酮（10μM）可显著降低突变组电流密度，差异有统计学意义（＃P＜0.05）；ERS治疗药物异丙肾上腺素（10μM）可增加野生型钙电流密度，对突变型钙电流的增加无统计学意义，可引起野生型和突变型钙电流的电压依赖性SSA均发生左移；奎尼丁（5μM）对野生型和突变型钙电流的幅度、密度和电压依赖性SSA均无任何影响。结论：
　　1. CACNA1C-Q1916R为功能丧失性突变，可使Cav1.2在mRNA和蛋白质水平表达量均降低，但不影响蛋白的定位及转运，突变可能通过减少细胞膜上有效Cav1.2数量而降低钙电流。
　　2. CACNA1C-Q1916R突变是引起本研究家系中ER表现及SCD的主要原因。
　　3.睾酮加剧CACNA1C-Q1916R突变钙电流密度减小，证实男性是突变携带成员发生SCD和ER表现的重要危险因素。
　　4.异丙肾上腺素可能对有ER表现及SCD高危的CACNA1C-Q1916R突变携带者有一定疗效。

目录

声明

中英文缩略词表

第1章 前言

1.1心原性猝死概述

1.2 ERS——良性/恶性？

1.3 L-型钙离子通道突变的致心律失常作用

第2章 心原性猝死大家系临床和尸检分析及遗传学检测

材料与方法

结果

讨 论

结论

第3章 CACNA1C基因突变致心原性猝死相关早期复极的细胞电生理机制及其药物干预探讨

材料与方法

结果

讨论

结论

全文总结

1.研究成果

2.研究不足及待解决问题

3.展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述一:心脏钙离子通道疾病

综述二:心原性猝死患者遗传检测的管理