高糖环境下人肾小管上皮细胞天然免疫信号TLR4与血管紧张素Ⅱ的对话关系及其病理生理改变

摘要

目的：通过研究高糖环境下人肾小管上皮细胞的TLR4信号表达，论证TLR4与血管紧张素II的对话关系以及由此引起的肾小管上皮细胞纤维化和炎症因子的变化，探讨糖尿病肾病的天然免疫发病机制。
　　方法：常规培养细胞后将细胞分5组：1、正常糖组（5.5mmol/L）2、甘露醇组3、AngⅡ组4、高糖组(25mmol/L)5、高糖+厄贝沙坦组，各组干预24小时后提取细胞总RNA及总蛋白，用实时定量PCR法检测TLR4、MyD88、HSP47 mRNA的表达，Western印迹检测TLR4、MyD88及NF-κB、CoIV、HSP47蛋白表达；分析高糖及AngⅡ对TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的影响。设计并合成3对人TLR4基因的特异性siRNA片段，以BLOCKIT Alexa Fluor用于阴性对照组，转染24小时后，在荧光显微镜下观察细胞转染效果，实时定量PCR检测TLR4 mRNA的表达。挑选沉默TLR4基因效果最佳的siRNA用于进一步实验，将细胞分为7组：1、正常糖组；2、高糖组；3、AngⅡ+阴性对照组；4、高糖+阴性对照组；5、AngⅡ组；6、AngⅡ+siRNA组；7、高糖+siRNA组。采用实时定量PCR法检测TLR4、MyD88、HSP47 mRNA的表达，Western印迹检测TLR4、MyD88、NFkB、CoIV、HSP47蛋白表达；用ELISA法检测巨噬细胞趋化蛋白1（MCP1）、白细胞介素6（IL6）的表达。
　　结果：与正常糖组比较，甘露醇组差异无统计学意义，排除了高渗作用。高糖组、血管紧张素组TLR4、MyD88、HSP47mRNA及TLR4、MyD88、NF-κB、CoIV、HSP47蛋白表达水平显著上调（p＜0.01），细胞上清MCP1、IL6水平亦升高明显（p＜0.01）；与高糖组比较，高糖+厄贝沙坦组TLR4、MyD88、HSP47mRNA及TLR4、MyD88、NFkB、CoIV、HSP47蛋白表达水平明显下调（p＜0.01），阴性对照组与高糖组、血管紧张素组比较，上述指标差异无统计学意义（p＞0.05）；siRNA组与高糖组、血管紧张素组比较TLR4、MyD88、HSP47mRNA明显下调（p＜0.01），TLR4、MyD88、NFkB、CoIV、HSP47蛋白明显下调（p＜0.01），MCP1、IL6表达亦下调（p＜0.01）。
　　结论：高糖激活人肾小管上皮细胞TLR4/Myd88/NF-κB信号并上调炎性因子和纤维化因子的表达。血管紧张素II与TLR4信号存在对话关系并上调炎症因子和纤维化因子的表达。厄贝沙坦可阻断由高糖及AngⅡ诱导的TLR4信号通路的激活。特异性基因沉默可通过阻断由高糖及AngⅡ诱导的TLR4信号通路，下调炎性因子及纤维化因子的释放，TLR4信号通路是高糖环境下肾小管上皮细胞炎性因子及纤维化因子上调的主要通路。

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中英文缩略词表

第1章 前言

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1细胞株

2.1.2主要试剂

2.1.3 主要仪器及耗材

2.2 方法

2.2.1配置实验所需溶液

2.2.2细胞实验方法（需在超净台内完成）

2.2.3 细胞转染

2.2.4实验分组

2.2.5荧光定量PCR（Real-time PCR）检测各组TLR4、MyD88、HSP47 mRNA的表达

2.2.6 Western blot检测CoIV、TLR4、MyD88、NF-κB、HSP47蛋白的相对表达量

2.2.7 ELISA分析细胞培养上清液中IL-6、MCP-1的表达量

2.2.8 统计学处理

第3章 结果

3.1荧光定量PCR检测TLR4、MyD88、HSP47 mRNA相对表达量

3.2Western blot检测各组细胞TLR4、MyD88、NF-κB、CoIV、HSP47蛋白的表达

3.3 细胞转染

3.4 细胞转染后荧光定量PCR检测TLR4、MyD88 、HSP47mRNA相对表达量

3.5 细胞转染后Western blot检测各组细胞TLR4、MyD88、NF-κB、CoIV、HSP47蛋白的表达

3.6 ELISA检测各组细胞培养上清液IL-6、MCP-1的表达：

第4章 讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

综述: TLR4信号通路在糖尿病肾病的表达和作用