二甲双胍对LPS诱导的巨噬细胞趋化因子表达的调节及其机制的探讨

摘要

背景与目的：
　　炎症反应参与多种疾病的发生发展，包括自身免疫性疾病、糖尿病、心血管疾病、肿瘤等。免疫细胞的招募和活化在炎症反应中发挥重要作用，巨噬细胞作为抵御外界刺激的第一道防线，是机体固有免疫的重要组成细胞。巨噬细胞激活后分泌大量趋化因子，趋化因子表达和功能异常与自身免疫性疾病、感染性疾病、糖尿病和肿瘤等炎症相关疾病密切相关。其中CC类和CXC类趋化因子是最主要的趋化因子家族，在调节炎症细胞和免疫细胞趋化迁移中发挥关键作用。大量研究表明临床上治疗糖尿病的常用药AMPK激活剂二甲双胍，具有明显的不依赖于降糖作用的抗炎效应，并且活化 AMPK可以抑制 NF-κB信号通路从而下调TNF-α等炎症因子。但是，迄今为止，AMPK是否影响趋化因子及其机制未见报道。本研究旨在观察AMPK激活剂二甲双胍对LPS诱导巨噬细胞趋化因子CCL2、CXCL10、CXCL11表达水平的影响及其机制。
　　方法：
　　1、分别观察LPS和二甲双胍对趋化因子表达的影响。不同浓度LPS处理巨噬细胞不同时间后，利用蛋白免疫印迹法检测细胞内 CXCL10、CXCL11的表达水平和AMPK磷酸化程度；二甲双胍处理细胞不同时间后，采用qRT-PCR检测CCL2、CXCL10、CXCL11 mRNA的表达水平，从而确定药物剂量和处理时间。
　　2、观察AMPK激活剂二甲双胍对LPS诱导的趋化因子mRNA水平的影响。实验分组：空白对照组、二甲双胍组、LPS组、LPS+二甲双胍组。RAW264.7巨噬细胞汇合度达到70％后，换成正常培养液或含有相应药物的培养液，处理相应时间后采用qRT-PCR检测CCL2、CXCL10、CXCL11mRNA表达情况。
　　3、观察AMPK抑制剂Compound C与二甲双胍共孵育对LPS诱导的趋化因子mRNA水平的影响，实验分组：空白对照组、二甲双胍组、LPS组、LPS+二甲双胍组、LPS+二甲双胍+Compound C组。RAW264.7巨噬细胞汇合度达到70%后，换成正常培养液或含有相应药物的培养液培养，处理相应时间后采用qRT-PCR检测CCL2、CXCL10、CXCL11mRNA表达水平。
　　4、观察Compound C与AMPK激活剂AICAR共孵育对LPS诱导的趋化因子mRNA水平的影响，实验分组：空白对照组、AICAR组、LPS组、LPS+AICAR组、LPS+AICAR+Compound C组。RAW264.7巨噬细胞汇合度达到70%后，换成正常培养液或含有相应药物的培养液培养，处理相应时间后采用qRT-PCR检测CCL2、CXCL10、CXCL11 mRNA表达量。
　　5、观察二甲双胍对 AMPK、NF-κB信号分子的影响。采用免疫蛋白印迹检测细胞内AMPK和ACC的磷酸化程度及NF-κB p65和IκB磷酸化水平。
　　结果：
　　1、LPS呈剂量和时间依赖性地诱导 RAW264.7细胞表达 CXCL10、CXCL11。
　　2、二甲双胍呈时间依赖性地下调RAW264.7细胞CCL2、CXCL10、CXCL11 mRNA表达水平。
　　3、二甲双胍能够抑制LPS诱导RAW264.7细胞CCL2、CXCL10、CXCL11 mRNA表达水平，并且AMPK抑制剂Compound C能够逆转二甲双胍的作用。
　　4、AICAR抑制LPS诱导RAW264.7细胞CCL2、CXCL10、CXCL11 mRNA表达水平，但是，AMPK抑制剂Compound C不能逆转AICAR的作用。
　　5、二甲双胍明显激活AMPK并抑制LPS诱导的IκB和p65（Ser536）磷酸化，但不影响p65(Ser276)磷酸化。
　　结论：
　　二甲双胍抑制LPS诱导巨噬细胞表达趋化因子CCL2、CXCL10和CXCL11，此效应很可能通过干预AMPK/NF-κB信号通路实现。

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中英文缩略词表

第1章 引言

1.1 趋化因子与炎症相关疾病

1.2 AMPK抗炎效应及相关机制

1.3 二甲双胍抗炎作用的研究现状

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

第3章 实验结果

3.1 LPS对RAW264.7巨噬细胞趋化因子和AMPK的影响

3.2二甲双胍抑制RAW264.7巨噬细胞趋化因子表达

3.3二甲双胍抑制LPS诱导RAW264.7细胞趋化因子表达

3.4 Compound C与二甲双胍共孵育对趋化因子的影响

3.5 Compound C与AICAR共孵育对趋化因子的影响

3.6二甲双胍对AMPK/NF-κB信号通路的影响

第4章 讨论

第5章 结 论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述: AMPK在慢性炎症性疾病中的研究进展