GDF-5联合淫羊藿素诱导BMSCs向类软骨细胞分化及机制的研究

摘要

目的：
　　研究生长分化因子5（growthdifferentiationfactor-5,GDF-5）联合淫羊藿素（Icaritin,ICT）诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs）向类软骨细胞分化，并进一步研究Wnt/β-catenin信号通路在其中的作用。
　　方法：
　　（1）全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠BMSCs，倒置相差显微镜观察细胞形态，CCK-8法测定细胞生长曲线。
　　（2）取培养至第3代对数生长期的BMSCs进行实验，根据诱导条件不同分为6组：BMSCs组、BMSCs+ICT组、BMSCs+GDF-5组、BMSCs+GDF-5+ICT组、BMSCs+GDF-5+ICT+SB216763组、BMSCs+GDF-5+ICT+XAV-939组，连续诱导培养14d后倒置相差显微镜观察细胞形态学改变。
　　（3）诱导培养14d后，AlcianBlue染色检测细胞的蛋白聚糖改变。
　　（4）诱导培养14d后，采用RT-PCR检测成软骨分化标记基因Aggrecan、COL2、Sox9的表达情况，WesternBlot检测COL2蛋白表达水平。
　　（5）诱导培养14d后，RT-PCR检测Wnt/β-catenin信号通路关键组件Dvl1、GSK-3β、β-cateninmRNA表达水平，采用WesternBlot检测β-catenin蛋白表达水平。
　　结果：
　　（1）大鼠BMSCs传至P3代，细胞形态基本均一，长梭形或扁平状，呈典型密集旋涡状、鱼群样排列贴壁生长。
　　（2）BMSCs组连续培养14d后，细胞排列紧密，并没有明显的细胞蓝染。BMSCs+ICT组，BMSCs+GDF-5组，BMSCs+GDF-5+ICT组，BMSCs+GDF-5+ICT+SB216763组细胞逐渐缩小，由长梭形逐渐向类圆形转变，并且蛋白聚糖蓝染逐渐加深。但GDF-5+ICT+XAV-939组相对GDF-5+ICT组，细胞形态改变较少，且染色相对较浅。
　　（3）软骨细胞标志检测结果：RT-PCR及WesternBlot检测结果分析表明，与BMSCs组相比，BMSCs+GDF-5组和BMSCs+ICT+GDF-5组软骨标记基因Aggrecan、Col2、Sox9表达量及Ⅱ型胶原蛋白表达量均明显增加（P＜0.05）。与BMSCs+GDF-5组比较，BMSCs+Icaritin+GDF-5联合组Aggrecan、Col2、Sox9基因表达量及Ⅱ型胶原蛋白表达量也增加（P＜0.05）。
　　（4）Wnt/β-catenin信号通路关键组件检测结果：与BMSCs相比，BMSCs+GDF-5组和BMSCs+ICT+GDF-5组Dvl1基因、β-catenin基因及蛋白表达明显增加，相应的GSK-3βmRNA表达量下降（P＜0.05）；与BMSCs+GDF-5组相比，BMSCs+GDF-5+ICT组Dvl1、β-cateninmRNA表达水平及β-catenin蛋白水平均增加，相应的GSK-3βmRNA表达量下降（P＜0.05）；与BMSCs+ICT+GDF-5组相比，BMSCs+ICT+GDF-5+SB216763组Aggrecan、Sox9和β-cateninmRNA表达量明显增加，GSK-3βmRNA表达量下降，Ⅱ型胶原蛋白及β-catenin蛋白表达也增加（P＜0.05）,相反BMSCs+ICT+GDF-5+XAV-939组Aggrecan、Col2、Sox9和β-cateninmRNA表达量明显减少，Ⅱ型胶原蛋白及β-catenin蛋白表达也减少（P＜0.05），GSK-3βmRNA表达量增加（P＜0.05）。
　　结论：
　　（1）GDF-5联合淫羊藿素能够诱导大鼠BMSCs成软骨分化，其中ICT起促进作用。
　　（2）Wnt/β-catenin信号通路在GDF-5联合淫羊藿素诱导大鼠BMSCs成软骨分化过程中发挥正向调控作用。