抑制乙型肝炎病毒e抗原表达的中药研究

摘要

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus, HBV）感染，以急、慢性肝损伤为主要临床表现，严重危害人类健康的一种传染性疾病。慢性乙型肝炎的发生发展与宿主的免疫应答、病毒的基因变异、环境以及遗传等诸多因素相关，如果长期得不到有效控制，慢性乙肝就极易发展为肝硬化和肝癌。
　　目前国内外用于治疗慢性乙肝的药物以干扰素类及核苷类为主。这两类药物虽然通过不同作用机制对HBV产生一定的抑制效果，但其不足之处也不容忽视，比如核苷类药物引起的耐药、干扰素昂贵的价格以及不可避免的药物副作用等等。我国中医中药具有资源优势，中医治疗的理论体系也相对成熟，特别是在缓解慢性乙肝患者临床症状等方面，中药的治疗效果显著，然而，乙肝的防治重点依然是抗病毒，从中药中发掘有效的抗HBV药物及活性成分，具有潜在的研究价值。
　　乙肝病毒基因组分为结构基因区及调节基因区两部分，结构基因区包括S、C、P和X四个开放读码框架，调节基因区则包括四个启动子（SP I，SPII，CP， XP）及两个增强子（Enh I，Enh II）。C基因在Enh II及CP调控下编码HBeAg和 HBcAg两个重要病毒蛋白，HBeAg经氨基端和羧基端的剪切修饰后可分泌到肝细胞外，HBcAg则是组装病毒颗粒中衣壳的重要元件。
　　目的：
　　构建由HBV EnhancerII+CP调控preC+C基因表达HBeAg的真核表达重组质粒，转染HepG2细胞，用中药处理转染细胞，观察中药对乙型肝炎病毒e抗原表达的抑制作用，从而筛选出具有抗HBV活性的中药。
　　方法：
　　1、筛选出感染乙肝病毒儿童患者阳性血清一份，提取HBV DNA。
　　2、PCR扩增HBV含EnhancerII+BCP+preC+C区域的DNA片段（HBV-C），电泳及胶回收纯化扩增产物。
　　3、纯化后的目的基因HBV-C及质粒载体pBudCE4.1通过Hind III及Xba I双酶切，将目的基因HBV-C插入到质粒载体pBudCE4.1中，构建得到重组质粒HBV-C/pBudCE4.1。
　　4、通过文献筛选出45种单味中药，制备成水煎剂并稀释成4个剂量梯度备用。
　　5、用脂质体瞬时转染的方式将HBV-C/pBudCE4.1导入人肝癌细胞HepG2。
　　6、将制备好的中药处理HepG2细胞，利用ELISA法检测细胞培养上清液及裂解液中HBeAg的含量，HBeAg的表达量以OD值记录。
　　7、数据用x±s表示。组间比较进行t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　质粒 DNA测序显示表达质粒 HBV-C/ pBudCE4.1构建成功，质粒转染HepG2细胞后可成功表达 HBeAg。抑制 HBeAg表达的中药研究显示，与无中药处理的细胞对照组相比，4个剂量（4 g/L、2 g/L、1 g/L、0.5g/ L）白马骨、黄芩、柴胡、毛鸡骨草处理的细胞培养上清液中 HBeAg的含量均显著下降（P<0.01），且药物抑制效果呈现剂量-效应关系；4 g/L槟榔、4 g/L女贞子、2 g/L阿魏、4 g/L虎杖也显示使细胞培养上清液中HBeAg的含量显著下降（P<0.01）；1 g/L女贞子、4 g/L的大黄、4 g/L黄芪处理的细胞上清液中HBeAg的含量有一定下降（P<0.05）。与细胞对照组相比，4个剂量（4 g/L、2 g/L、1 g/L、0.5g/L）剂量的白马骨及柴胡处理的细胞裂解液中HBeAg的含量显著下降（P<0.01），药物的抑制作用呈现剂量-效应关系；4g/L、2g/L、1g/L剂量的黄芩及毛鸡骨草使细胞裂解液中HBeAg的含量显著下降（P<0.01），且呈现剂量-效应关系；4 g/L阿魏使细胞裂解液中HBeAg的含量显著下降（P<0.01）。
　　结论：
　　中药白马骨、黄芩、柴胡和毛鸡骨草中可能含有某些小分子成分，下调了HBV增强子 II和核心启动子对前C区基因的表达启动，从而减低了乙型肝炎病毒e抗原的分泌量。

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缩略词表

第1章 引 言

第2章 实验材料

2.1 基本材料

2.2 主要仪器

2.3 主要试剂

第3章 实验方法

3.1 HBV-C/pBudCE4.1重组质粒的构建

3.2 人肝癌细胞HepG2的培养

3.3 药物实验

第4章 结果

4.1 HBV-C基因PCR扩增结果

4.2 HBV-C、pBudCE4.1双酶切产物鉴定结果

4.3 重组质粒HBV-C/pBudCE4.1的酶切鉴定结果

4.4 重组质粒DNA测序结果

4.5 中药对HepG2细胞培养上清液中HBeAg的表达抑制作用

4.6 中药对HepG2细胞裂解液中HBeAg的表达抑制作用

第5章 讨 论

5.1 HBeAg、HBcAg的结构与功能

5.2实验对象及实验方法的选择

5.3药物实验结果的分析

致谢

参考文献

附录

攻读学位期间的研究成果

综述: 中医药抗乙肝病毒实验研究进展