高糖调节RANKL诱导后的RAW264.7细胞破骨分化及其机制探索

摘要

第一部分高糖对RANKL诱导后的RAW264.7细胞增殖和破骨分化的影响
　　目的：
　　用RANKL诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞分化为成熟的破骨细胞，探讨高糖环境下对RANKL诱导后的破骨细胞的影响。
　　方法：
　　体外培养RAW264.7细胞，用50ng/ml RANKL配成诱导培养基去诱导细胞，分组如下：空白对照组（无RANKL）、Control组（葡萄糖5.5mmol/L+RANKL），实验组（以不同浓度梯度的葡萄糖11,22,33,44mmol/L+RANKL）培养细胞6d：用MTT法测定细胞活力和Western blot法检测CyclinD1蛋白水平的表达；用TRAP染色和OAAS法，观察破骨细胞内TRAP+细胞形成情况和骨陷窝面积大小。
　　结果：
　　MTT结果显示，与Control组相比，高糖(22mM)可以显著促进破骨细胞的活力(P＜0.01)，而在11，33，44mmol/L时并无显著性差异；Western Blot的结果显示，与Control组相比，高糖（22mmol/L）组上调CyclinD1的表达最明显；TRAP染色法结果显示，与Control组相比，高糖抑制了破骨细胞的分化，且呈一定的浓度-依赖性(P＜0.01)；OAAS法结果显示，与Control组相比，高糖抑制了破骨细胞的吸收，且呈一定的浓度-依赖性(P＜0.01)。
　　结论：
　　高糖（22mM）可明显促进RANKL诱导后的RAW264.7细胞的增殖，同时高糖以剂量依赖的方式抑制其破骨分化功能。
　　第二部分高糖调节RANKL诱导后的RAW264.7细胞破骨分化的机制探索
　　目的：
　　用RANKL诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞分化为成熟的破骨细胞，探索高糖环境下对RANKL诱导后的破骨细胞的形成机制。
　　方法：
　　1.体外培养RAW264.7细胞，用不同浓度的葡萄糖联合RANKL去培养细胞24h：用Western blot法检测PI-3K，pAkt/Akt的表达。
　　2.体外培养RAW264.7细胞，为确定高糖(22mM)对RANKL诱导后的破骨细胞的增殖最显著，而在33,44mM时是下降的，是否受到高渗的影响，用RANKL诱导，培养细胞6d：用MTT法检测细胞的活力和Western blot法检测CyclinD1的表达。
　　3.体外培养RAW264.7细胞，为了探索氧化应激对破骨细胞的形成作用，用RANKL诱导，培养细胞24h：用荧光显微镜检测细胞内的活性氧水平；检测细胞内氧化应激四个指标CAT、GPX、SOD、MDA的含量。
　　结果：
　　1.Western Blot的结果显示：用不同浓度葡萄糖处理，与Control相比，高糖组的PI-3K和p-AKt/Akt蛋白水平以剂量依赖的方式增加，但44mmol/L葡萄糖组上升程度更显著(P＜0.01)。
　　2.为确定高糖(22mM)对RANKL诱导后的破骨细胞的增殖最显著，而在33,44mM时是下降的，是否受到高渗的影响。结果显示：与Control组相比，高糖(22mM)组对破骨细胞的增殖最明显(P＜0.01)，不同高糖与高渗组成的22mM浓度和33mM浓度对细胞增殖无显著性差异（P﹥0.05）。与Control组相比，高渗的11,22,33,44mM组以剂量依赖性的方式抑制了破骨细胞的增殖和CyclinD1蛋白水平的表达(P＜0.01)。因此，高渗以剂量依赖方式抑制细胞CyclinD1的表达，抑制细胞增殖，和不同浓度的高糖通过上调PI-3K和p-AKt的表达以剂量依赖的方式促进细胞增殖，不同高糖与高渗组成的不同浓度对细胞增殖没有影响，这表明高糖(22mM)促进破骨细胞的增殖，而在33,44mM时是下降的，与高渗有关。
　　3.ROS检测结果显示：与Control组相比，11,22,33,44mM组均能显著降低破骨细胞内ROS水平(P＜0.01)；这表明高糖能显著抑制RANKL诱导后的破骨细胞内的活性氧水平。
　　4.观察高糖（22mM）预处理对诱导前和诱导后的破骨细胞内CAT、GPX、SOD和MDA的影响：与空白对照组相比，RANKL组和高糖（22mM）组单独处理RAW264.7细胞后，细胞内的CAT、GPX及SOD含量显著降低，MDA水平显著升高(P＜0.01)；与Control组相比，当高糖（22mM）组和RANKL联合作用于RAW264.7后，细胞内CAT、GPX及SOD含量显著升高，MDA水平显著降低(P＜0.01)。
　　5.观察不同高糖预处理对RANKL诱导后的破骨细胞内CAT和MDA的影响：与Control组相比，11,22,33,44mM组细胞内CAT含量显著升高，MDA水平显著降低(P＜0.01)，但是细胞内GPX和SOD水平没有明显变化。
　　结论：
　　1.高糖促进RANKL诱导的RAW264.7细胞的增殖，其机制与上调PI3K/Akt通路有关，与高渗有关。
　　2.高糖抑制RANKL诱导的RAW264.7细胞的分化和骨吸收，其机制可能与抑制氧化应激有关。

目录

声明

中英文缩略词表

第1章 引 言

第 2 章 材料与试剂

2.1 主要材料与试剂

2.2 实验主要仪器和设备

2.3 主要试剂的配制

第3章 实验方法

3.1 小鼠单核巨噬细胞 RAW264.7的培养

3.2 实验分组及处理方法

3.3 数据处理

第4章 实验结果

第一部分 高糖对RANKL诱导后的RAW264.7细胞增殖和破骨分化的影响

第二部分 高糖调节RANKL诱导后的RAW264.7细胞破骨分化的机制探索

第 5 章 讨论

第6章 结论与展望

6.1结论

6.2 展望

致谢

参考文献

综述:糖尿病骨质疏松症发病机制的研究进展