自噬在晚期糖基化终末产物诱导大鼠软骨细胞凋亡与促MMP-3及MMP-13表达中的作用

摘要

研究背景和目的：
　　骨性关节炎（osteoarthritis，OA）的主要致病因素是高龄，高龄导致的 OA常伴随关节软骨内晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）的蓄积增多。OA的典型病理特征是软骨细胞凋亡和细胞外基质的降解，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)在软骨分解代谢中发挥重要作用，能降解多种细胞外基质( extracellular matrix，ECM)蛋白。自噬（autophagy）是一种生理或病理条下应激调控机制，主要通过降解细胞中的大分子和受损的细胞器来维持细胞内环境稳定。我们推测自噬在AGEs引起OA病理变化中具有重要作用。因此，本研究拟探讨AGEs对软骨细胞凋亡及MMP-3和MMP-13的表达影响，并进一步阐明自噬在AGEs引起软骨细胞的病理变化过程的作用。
　　方法：
　　（1）大鼠关节软骨细胞分离培养，取第2代细胞进行甲苯胺蓝染色、阿尔新蓝染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色；
　　（2）不同浓度AGEs处理软骨细胞24h后，CCK-8法和Western blot分别检测软骨细胞生存率及MMP-3和MMP-13的蛋白表达水平；
　　（3）AGEs处理软骨细胞不同时间后，Annexin V-FITC/PI流式细胞术和Western blot分别检测软骨细胞凋亡率及MMP-3和MMP-13的蛋白表达水平；
　　（4） AGEs处理软骨细胞不同时间后， Western blot检测自噬相关蛋白Beclin-1及LC3B表达水平，并通过mCherry-GFP-LC3B腺病毒转染软骨细胞并与AGEs培养后，荧光显微镜下观察细胞自噬流变化；
　　（5）分别以自噬阻滞剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）及自噬激活剂雷帕霉素（rapamycin, RA）预处理软骨细胞1h后，再加入AGEs共培养， Annexin V-FITC/PI流式细胞术和 Western blot分别检测软骨细胞凋亡率及MMP-3和MMP-13的蛋白表达水平。
　　结果：
　　（1）软骨细胞呈三角形或多角形贴壁生长。甲苯胺蓝染色见软骨细胞包浆蓝色，细胞核紫蓝色。阿尔新蓝染色后细胞质呈淡蓝色。Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色见细胞质黄色，细胞核周围散在棕黄色颗粒；
　　（2）不同浓度AGEs（0,10,25,50,100,200μg/mL）处理软骨细胞24h，50,100,200μg/mL浓度AGEs可显著降低软骨细胞存活率(P＜0.01)，不同浓度AGEs（25,50,100μg/mL）处理软骨细胞24h后， MMP-3及MMP-13蛋白表达量较对照组均显著升高，并随浓度增加而增加(P＜0.01)；
　　（3）100μg/mL AGEs处理软骨细胞不同时间（0,3,6,12,24h）后，Beclin-1及 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达量于6h(p＜0.01)表达量最高，并随时间推移而下降。100μg/mL AGEs处理mCherry-GFP-LC3B腺病毒转染的软骨细胞后，软骨细胞红色荧光于6h显著增加(P＜0.01)；
　　（4）100μg/mL AGEs处理软骨细胞不同时间（0,3,6,12,24h）后，处理6h后软骨细胞凋亡率较正常组显著增加(p＜0.01)，处理3h后MMP-3及MMP-13表达量较正常组显著增加(P＜0.05)；
　　（5）分别3-MA(5mM)和RA(5μM)预处理软骨细胞1h后与100μg/mL AGEs共培养6h,3-MA+AGEs组较AGEs组凋亡率及MMP-3和MMP-13蛋白表达量显著增加(p＜0.01)，RA+AGEs组较AGEs组凋亡率及MMP-3和MMP-13蛋白表达量显著降低(P＜0.01)。
　　结论：
　　（1）AGEs可诱导软骨细胞凋亡并提高软骨细胞中MMP-3和MMP-13的表达；
　　（2）自噬参与AGEs诱导软骨细胞的病理过程，并对AGEs所致软骨细胞凋亡及MMP-3和MMP-13的表达起保护作用。

目录

声明

中英文缩略词

第1章 引言

第2章 材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 主要仪器与试剂

2.2 实验方法

2.2.1 主要试剂配制

2.2.2 大鼠关节软骨细胞的分离培养

2.2.3 大鼠关节软骨细胞的形态学鉴定

2.2.4 CCK-8法检测软骨细胞生存率

2.2.5 实验设计与分组

2.2.6 Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测软骨细胞凋亡率

2.2.7 mCherry-GFP-LC3B腺病毒转染软骨细胞检测自噬流

2.2.8 Western blot 检测相关蛋白表达水平

2.3 统计学处理

第3章 结果

3.1 软骨细胞的鉴定

3.2 不同浓度AGEs对软骨细胞的影响

3.2.1 不同浓度AGEs对软骨细胞生存率的影响

3.2.2 不同浓度AGEs对软骨细胞MMP-3和MMP-13的影响

3.3 AGEs对软骨细胞自噬的影响

3.3.1 自噬相关蛋白水平的检测结果

3.3.2 自噬流检测结果

3.4 AGEs对软骨细胞凋亡的影响

3.5 AGEs对软骨细胞基质金属蛋白酶表达的影响

3.6 自噬在AGEs引起软骨细胞病理变化中的作用

3.6.1 自噬对AGEs引起软骨细胞凋亡的影响

3.6.2 自噬对AGEs引起软骨细胞基质金属蛋白酶表达的影响

第4章 讨论

4.1 软骨细胞的培养与鉴定

4.2 AGEs对软骨细胞的影响

4.3 自噬对软骨细胞的影响

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述:晚期糖基化终末产物与骨性关节炎相关性的研究进展