刺头复叶耳蕨总黄酮对人脐带间充质干细胞成骨分化的作用及机制研究

摘要

目的：
　　研究刺头复叶耳蕨总黄酮（total flavonoids from arachniodes exilis，TFAE)在人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）成骨分化中的作用，并进一步研究雌激素受体（estrogen receptor，ER）信号途径在其中的作用。
　　方法：
　　(1)采用组织块贴壁法分离、培养hUCMSCs，倒置相差显微镜观察细胞形3 hUCMSCs
　　(2)TFAE对hUCMSCs活性的影响：实验分为5组：0μg/mLTFAE组(对照组)，1μg/mLTFAE组，5μg/mLTFAE组，10μg/mLTFAE组，20μg/mLTFAE组，分别作用24h、48h、72h后，CCK-8法检测细胞活性。
　　(3)TFAE对hUCMSCs成骨分化的影响：根据细胞活性检测结果，实验分为4组：对照组（常规培养基），0μg/mLTFAE组（0μg/mLTFAE的成骨诱导培养基），1μg/mLTFAE组（1μg/mLTFAE的成骨诱导培养基），5μg/mLTFAE组（5μg/mLTFAE的成骨诱导培养基），诱导培养3d、7d后，AMP法测定ALP活力；诱导培养14d后，茜素红染色检测钙结节，RT-PCR检测成骨相关基因Ⅰ型胶原a1(collagen type I alpha1, Col1a1)、骨桥蛋白(osteopotin, OPN)、Runx2、Osterix（Osx）mRNA表达水平。
　　(4)ER在hUCMSCs成骨分化中的作用：实验分为4组：对照组（0μg/mLTFAE的成骨诱导培养基），TFAE组（5μg/mLTFAE的成骨诱导培养基），TFAE+S组（5μg/mLTFAE的成骨诱导培养基+S1191），S组(S1191），诱导培养3d、7d后，AMP法测定ALP活力；诱导培养14d后，茜素红染色检测钙结节，RT-PCR检测成骨相关基因Col1a1、OPN、Runx2、OsxmRNA表达水平。
　　结果：
　　(1)脐带组织贴壁培养3-5d后，培养皿中有细胞长出，培养10-14d，组织块周围长满成纤维样细胞，经传代培养后，细胞形态均一，贴壁良好。
　　（2）细胞活性检测结果：CCK-8检测结果显示，与对照组相比，1μg/mLTFAE组、5μg/mLTFAE组细胞活性明显增强（P＜0.05或P＜0.01），10μg/mLTFAE组、20μg/mLTFAE组细胞活性明显减弱（P＜0.05或P＜0.01）。
　　（3）hUCMSCs成骨分化检测结果：1）ALP检测结果显示：与对照组相比，0μg/mLTFAE、1μg/mLTFAE组及5μg/mLTFAE组细胞ALP活力明显增强（P＜0.05或P＜0.01），与0μg/mLTFAE组，1μg/mLTFAE组及5μg/mLTFAE组细胞ALP活力也明显增强（P＜0.05或P＜0.01）；2）茜素红染色结果显示：不同浓度TFAE组均有钙结节形成，而对照组未见钙结节，与0μg/mLTFAE组相比，1μg/mLTFAE组及5μg/mLTFAE组钙结节数量明显增多（P＜0.01）；3）RT-PCR检测结果显示：与对照组相比，0μg/mLTFAE组、1μg/mLTFAE组及5μg/mLTFAE组成骨相关基因 Col1a1、OPN、Runx2、OsxmRNA表达量明显增加（ P＜0.01），与0μg/mLTFAE组相比，1μg/mLLTFAE组及5μg/mLTFAE组Col1a1、OPN、Runx2、OsxmRNA表达量也明显增加（P＜0.05或P＜0.01）。
　　（4）ER抑制剂作用下，hUCMSCs成骨分化检测结果：
　　1）ALP检测结果显示：与对照组相比，TFAE组细胞ALP活力明显增强（P＜0.01），与TFAE组相比，TFAE+S组细胞ALP活力明显减弱（P＜0.05或P＜0.01），对照组与S组无差异；
　　2）茜素红染色结果显示：各组均有钙结节形成，与对照组相比，TFAE组钙结节数量增多（P＜0.01），而与TFAE组相比，TFAE+S组钙结节数量明显减少（P＜0.01），对照组与S组无差异；
　　3）RT-PCR检测结果显示：与对照组相比，TFAE组成骨相关基因Col1a1、OPN、Runx2、OsxmRNA表达量明显增加（P＜0.01），与TFAE组相比，TFAE+S组Col1a1、OPN、Runx2、OsxmRNA表达量明显减少（P＜0.05或P＜0.01），对照组与S组无差异。
　　结论：
　　（1）一定浓度的TFAE增强hUCMSCs活性及促进其成骨分化。
　　（2）TFAE通过ER信号途径促进hUCMSCs成骨分化。

目录

声明

中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 脐带来源

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器倒置荧光显微镜

2.2 实验方法

2.2.1 器材的准备

2.2.2 hUCMSCs分离、培养

2.2.3 TFAE对hUCMSCs活性的影响

2.2.4 TFAE对hUCMSCs成骨分化的影响

2.2.5 ER在hUCMSCs成骨分化中的作用

2.3 统计学处理

第3章 结果

3.1 hUCMSCs形态学观察

3.2 hUCMSCs活性检测结果

3.3 hUCMSCs成骨分化检测结果

3.3.1 ALP检测结果

3.3.2 茜素红染色结果

3.3.3 RT-PCR检测结果

3.4 ER抑制剂作用下，hUCMSCs成骨分化检测结果

3.4.1 ALP检测结果

3.4.2 茜素红染色结果

3.4.3 RT-PCR检测结果

第4章 讨论

4.1 hUCMSCs概述

4.2 一定浓度的TFAE增强hUCMSCs活性及促进其成骨分化

4.3 TFAE通过ER信号途径促进hUCMSCs成骨分化

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述:脐带间充质干细胞治疗骨缺损的研究进展