RNAi沉默CAPN1基因对Aβ25-35诱导的原代神经元细胞损伤及凋亡的影响

摘要

目的与背景： 阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是最常见的慢性神经退行性疾病，在AD病变中钙蛋白酶过度活化，加剧AD疾病进展。因此，抑制钙蛋白酶对治疗AD具有重要意义，但因钙蛋白酶种类繁多，参与多种生理活动。目前尚无特异性的钙蛋白酶抑制剂。因此，本研究采用RNAi沉默CAPN1基因，利用Aβ25-35诱导的AD样细胞模型，观察RNAi沉默CAPN1表达对Aβ25-35诱导的原代皮层神经细胞的神经毒性及凋亡的影响。 方法： 实验分组：1）原代胎鼠皮层神经元+ PBS；2）原代胎鼠皮层神经元+阴性参照毒液+10μM Aβ25-35；3）原代胎鼠皮层神经元+CAPN1 shRNA慢病毒+10μM Aβ25-35；4）原代胎鼠皮层神经元+CAPN1 shRNA慢病毒+10μM Aβ25-35+2ug/ml p25；各组转染慢病毒48小时后，再加各种药物，再培养72h。CCK-8法检测神经元细胞活力的变化情况，Annexin V-PI方法进行细胞凋亡检测，Real-Time PCR检测转染CAPN1 RNAi后CAPN1 mRNA的表达水平，Western blotting检测μ-calpain，CDK5，GSK-3β，p-tau/tau蛋白表达的变化。 结果： （1）CCK8检测结果显示，与NC对照组相比，NC+Aβ组细胞活力显著下降，转染CAPN1 shRNA后细胞活力有显著升高(p＜0.05)；与CAPN1 shRNA+Aβ组相比，CAPN1 shRNA+Aβ+p25组细胞活力无显著性差异(p＞0.05)； （2）Annexin V-PI凋亡实验结果表明，与NC组相比，转染CAPN1 shRNA后细胞凋亡比例显著升高(p＜0.01)；而转染CAPN1 shRNA后，与模型组相比， CAPN1shRNA+Aβ组凋亡率显著降低（p＜0.05）。而在 CAPN1shRNA+Aβ+p25组，细胞凋亡较CAPN1shRNA+Aβ组增强，但无统计学意义（p＞0.05）。 （3）RT-PCR检测结果表明，与 NC+Aβ组相比，CAPN1 shRNA+Aβ组CAPN1 mRNA的表达显著得到抑制；shCAPN1+Aβ+p25组中mRNA表达水平较CAPN1 shRNA+Aβ组有所上调，但无统计学意义（p＞0.05）。 （4）western blot方法检测蛋白表达情况，结果：与 NC组相比，NC+Aβ组中μ-calpain，CDK5，p-tau/tau蛋白表达水平显著升高（p＜0.01），GSK-3β蛋白表达水平升高（p＜0.05）；而转染CAPN1 shRNA后，与NC+Aβ组模型组相比，μ-calpain，GSK-3β，p-tau/tau蛋白表达水平下降（p＜0.01），CDK5蛋白表达水平降低（p＜0.05）；在加入P25后（CAPN1 shRNA+Aβ+P25组），CDK5， GSK-3β，p-tau/tau蛋白表达水平均有所上调，μ-calpain蛋白表达未见明显改变（p＞0.05）。 结论： RNAi沉默CAPN1基因，通过下调μ-calpain，可以显著改善Aβ25-35诱导的原代神经细胞的神经毒性损害，其作用机制可能是通过下调 CDK5，GSK-3β激酶蛋白， p-tau蛋白表达水平来实现的。

目录

声明

中英文缩略词表

第1章 引言

1.1 阿尔茨海默病发病机制进展

1.2 阿尔茨海默病与细胞凋亡

1.3μ-calpain与凋亡途径

第2章 材料与仪器

2.1 材料

2.2 主要仪器

第3章 实验方法

3.1 主要溶液配制

3.2 CAPN1 shRNA重组慢病毒载体构建（neuro-2a-CAPN1 shRNA）筛选

3.3原代皮层神经元细胞培养

3.4 实验分组

3.5 CCK-8法观察各组细胞活力的变化

3.6 Annexin V/PI流式检测

3.7 实时荧光定量PCR检测μ-calpain的表达变化

3.8 western blot（WB）方法检测细胞内相关蛋白的表达

3.9 统计学处理

第4章 结果

4.1 慢病毒介导μ-calpain基因有效干扰片段筛选

4.2 RNAi沉默CAPN1基因对神经元细胞活力的影响

4.3 RNAi沉默CAPN1基因对神经元细胞凋亡的影响

4.4 RNAi沉默CAPN1基因对神经元细胞CAPN1 mRNA表达水平的影响

4.5 RNAi沉默CAPN1基因对神经元细胞相关蛋白表达水平的影响

第5章 讨论

5.1 Aβ25-35诱导的细胞损伤及凋亡的影响

5.2 RNAi沉默CAPN1基因对Aβ25-35诱导的神经毒性作用及CDK5/GSK-3β通路的影响

5.3 p25在RNAi沉默CAPN1基因中对Aβ25-35引起的CDK5/GSK-3β通路的影响

第6章 结论与展望

6.1 全文总结

6.2 不足之处与展望

致谢

参考文献

附录：本研究资助项目

攻读学位期间的研究成果

综述: 钙蛋白酶与阿尔茨海默病