低强度脉冲超声预处理对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用及机制

摘要

背景： 缺血再灌注(IR)是临床上肺移植、体外循环、肺袖式切除、创伤、心肺复苏等情况下引起急性肺损伤( ALI)的主要原因。ALI患者即便有重症支持疗法，死亡率仍在30-40%以上。其病理表现为肺内严重的炎症反应、炎症细胞浸润、肺上皮和内皮细胞损伤以及气血屏障的失调。IR后的炎症反应是引起并加重其继发性损伤的因素之一，在炎症反应过程中，多种炎症因子和炎症介质共同参与，引起和加重IR后的损伤。胆碱能抗炎通路(CAP)是联系神经和免疫系统的调节通路，为炎症反射中的重要环节，通过激活或抑制CAP干预调节全身炎症和免疫反应，已渐渐成为联系神经与免疫系统的重要研究靶点。以超声为基础的治疗方法通过刺激了脾脏的一种固有的依赖于α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAchR)的CAP达到抑制炎症反应，从而减轻组织炎性反应与氧化应激反应，这为肺缺血再灌注损伤(LIRI)肺保护提供了新的思路和方法。 第一部分 LIPUS预处理对远隔器官肺缺血再灌注损伤的影响 目的： 通过建立LIRI大鼠模型，探讨低强度脉冲超声(LIPUS)预处理对LIRI炎症反应的影响。 方法： 选用雄性SD大鼠30只，8-12周龄，体重200-250g。随机分为三组，10%水合氯醛5 ml/kg腹腔注射麻醉后,气管插管接动物小动物呼吸机，呼吸频率70bpm，吸呼比为1：2，潮气量：10~12ml/kg。对照组(S组)，开胸游离左肺门，未行阻断；缺血再灌注组(IR组)，建立大鼠左肺缺血再灌注肺损伤实验模型。于左前胸第5肋间开胸，游离左肺门，生理盐水稀释50 U肝素至500μL经尾静脉注射，10 min后于肺充盈末用无创微血管夹夹闭左肺门，缺血45 min，再灌注180 min；低强度脉冲超声预处理组(L组)，采用低强度超声波治疗仪探头直径为1.5 cm，频率1.02 MHz，其声功率为0.8 w/cm2，脉冲波。将大鼠麻醉后置于试验台，超声定位脾脏辐照30min，然后同IR组处理。实验结束后，左房放血处死动物，切开胸腔取下整个左肺组织。HE染色做肺组织病理切片，测定肺湿/干重比值；比色法测定MDA和SOD检测；酶联免疫分析(ELISA)法测定肺组织匀浆中IL-1和IL-6浓度；免疫组化法检测TNF-α蛋白的表达。 结果： IR后肺组织出现明显损伤，与对照组相比较，IR后肺泡壁增厚和水肿程度较大，肺组织病理学评分显著增高（P<0.05），肺组织湿/干重比升高，MDA含量增加，SOD活性被抑制，IL-1、IL-6和TNF-α炎性指标升高；给予LIPUS预处理后L组较IR组肺组织病理学评分显著降低（P<0.05），肺组织湿/干重比降低，MDA含量减少，SOD活性被抑制程度降低，IL-1、IL-6和TNF-α炎性指标明显降低(P<0.05)。 结论： 在大鼠LIRI模型中，通过给予LIPUS预处理可以改善大鼠LIRI后肺组织炎性渗出，降低W/D值和MDA含量，减少对SOD活性的抑制，减少IL-1,IL-6和TNF-α炎性细胞因子的水平而发挥LIRI后抗炎作用，对大鼠LIRI具有保护作用。 第二部分 LIPUS预处理对远隔器官肺缺血再灌注损伤保护机制的研究 目的： 通过建立LIPUS预处理LIRI大鼠模型，研究CAP在LIPUS预处理减轻LIRI中的作用，探讨LIPUS预处理的保护机制。 方法： 选用雄性SD大鼠40只，8-12周龄，体重200-250g。随机分为四组，10%水合氯醛5 ml/kg腹腔注射麻醉后,气管插管接动物小动物呼吸机，呼吸频率70bpm，吸呼比为1：2，潮气量：10~12ml/kg。对照组(S组)，开胸游离左肺门，未行阻断；缺血再灌注组(IR组)，建立大鼠左肺缺血再灌注肺损伤实验模型。于左前胸第5肋间开胸，游离左肺门，生理盐水稀释50 U肝素至500μL经尾静脉注射，10 min后于肺充盈末用无创微血管夹夹闭左肺门，缺血45 min，再灌注180 min；低强度脉冲超声预处理组(L组)，采用低强度超声波治疗仪探头直径为1.5 cm，频率1.02 MHz，其声功率为0.8 w/cm2，脉冲波。将大鼠麻醉后置于试验台，超声定位脾脏辐照30min，然后同IR组处理。腹腔注射α7nAchR拮抗剂甲基牛扁亭2mg/Kg组(LA组),30min后同L组处理。实验结束后，左房放血处死动物，切开胸腔取下整个左肺组织。Western Blot检测α7nAChR、NF-κBp65蛋白表达；免疫荧光检测NF-κB p65核移位情况，q-PCR检测肺组织TNF-αmRNA相对定量表达。 结果： 在未进行IR处理，α7nAchR蛋白有少量表达，NF-κB p65主要分布在胞浆中，NF-κB p65蛋白和TNF-αmRNA仅有少量表达；当行IR处理后，α7nAchR蛋白表达有所增加，NF-κB p65从胞浆向细胞核移位，NF-κB p65蛋白表达明显增加，TNF-αmRNA表达明显增加(P<0.05)；而LIPUS预处理组，α7nAchR蛋白表达明显升高，NF-κB p65的核移位受到明显抑制(P<0.05)，NF-κB p65蛋白表达明显降低，TNF-αmRNA表达降低；但在给予腹腔注射α7nAChR拮抗剂甲基牛扁亭2mg/Kg后再进行LIPUS预处理和IR处理，NF-κB p65从胞浆向细胞核移位阳性细胞数明显增加，NF-κB p65蛋白表达明显增加，TNF-αmRNA表达明显增加(P<0.05)。 结论： 在大鼠LIRI模型中，通过给予LIPUS预处理可以激活依赖于α7nAchR的胆碱能抗炎通路，抑制NF-κB移位和活化，降低炎性细胞因子TNF-αmRNA的表达水平，对LIRI发挥保护作用。

目录

声明

中英文缩略词表

前言

第一部分 LIPUS预处理对远隔器官肺缺血再灌注损伤炎症反应的影响

第一章 引言

第二章 材料与方法

2.1主要仪器和试剂

2.2实验方法

2.3 指标测定及操作流程

2.4 统计分析

第三章 结果

3.1 肺组织HE病理切片结果

3.2 肺组织湿/干重比（W/D）

3.3 肺组织匀浆中MDA含量和SOD活力

3.4 肺组织匀浆中IL-1和IL-6含量

3.5 肺组织TNF-α蛋白表达免疫组化结果

第四章 讨论

4.1 IR与肺损伤

4.2 LIPUS预处理对肺IR后炎性渗出的影响

4.3 LIPUS预处理对肺IR后氧自由基的影响

4.4 LIPUS预处理对肺IR后炎性因子的影响

第五章 结论

参考文献

第二部分 LIPUS预处理对远隔器官肺缺血再灌注损伤保护机制的研究

第一章 引言

第二章 材料与方法

2.1主要仪器和试剂

2.2实验方法

2.3指标测定及操作流程

2.4统计分析

第三章 结果

3.1 Western Blot检测α7nAChR蛋白表达

3.2 Western Blot检测NF-κB p65蛋白表达

3.3免疫荧光检测NF-κB p65核移位

3.4 肺组织TNF-αmRNA相对定量表达

第四章 讨论

4.1 LIPUS预处理刺激脾脏激活α7nAchR

4.2 LIPUS预处理通过激活a7nAchR抑制NF-κB活化

第五章 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间的研究成果

综述:胆碱能抗炎通路在缺血再灌注急性肺损伤中的作用