防治仔猪大肠杆菌性腹泻复合型全蛋粉的初步研制

摘要

研究内容一：两种方法检测卵黄抗体效价的比较 为了确定一种特异性强、敏感性高、简便、快捷的抗体检测方法，本研究在用F41油佐剂灭活苗免疫蛋鸡获得卵黄抗体后，分别用微量凝集法和琼脂扩散法检测卵黄抗体中F41抗体的效价，比较两种方法测定结果的差异。结果表明，两种方法均可以用于卵黄抗体效价的检测，琼脂扩散法测定的结果比微量凝集法测定的结果高两个滴度。鉴于微量凝集法的快速、经济等优点，该方法被确定为后期实验中血清抗体和卵黄抗体效价的测定方法。 研究内容二: 鸡抗猪大肠杆菌血清抗体和卵黄抗体动态变化规律及其相互关系的研究 用猪源大肠杆菌四价(K88、K99、987P、F41)灭活疫苗免疫产蛋鸡，微量凝集法定期检测蛋鸡血清抗体和卵黄抗体的效价。结果表明，血清抗体比卵黄抗体出现早，免疫蛋鸡血清中和卵黄中四种抗体的消长规律基本相似，但不同抗体水平之间存在一定的差异；整个实验期间血清抗体水平均比卵黄抗体水平高。 研究内容三:重组人溶菌酶在鸡蛋清中的表达与卵黄抗体效价相互关系的研究 本实验按菌苗免疫组，质粒注射组，菌苗免疫质粒注射组，把鸡只分为三组，微量凝集法测定卵黄抗体的效价，RBB-R染料法检测人溶菌酶的表达量。结果表明菌毛免疫组卵黄抗体的效价和质粒注射组人溶菌酶的表达量和表达时间与菌苗免疫质粒注射组的结果相似，说明菌苗免疫同时注射质粒对卵黄抗体效价和人溶菌酶表达几乎没有影响，证实了两者结合应用的可行性，为全蛋粉的研制和人溶菌酶的生产奠定了基础。 由产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)引起的仔猪腹泻是一种常见病，该病具有发病急，传播快，死亡率高等特点，严重危害养殖业。ETEC主要有两类毒力因子，即肠毒素(ST和LT)和黏附素性菌毛。ETEC首先通过黏附素性菌毛与小肠黏膜上皮细胞上的特异性受体相结合而定居下来，继而大量增殖，产生并积累肠毒素使肠上皮细胞分泌功能亢进而发生腹泻。生产上防制该病主要是使用大肠杆菌多价苗和基因工程苗免疫母畜以保护仔畜免遭侵害，但母源抗体持续时间短，且存在个体差异，不足以保护整个仔畜生长阶段。治疗多采用抗菌药物或动物高免血清，但长期服用抗生素容易产生耐药性和药物残留，对人、畜的健康造成危害；用特异性抗体阻断ETEC对小肠上皮细胞的黏附是防治本病的有效手段。仔畜口服高免疫血清虽然能够预防腹泻，但因其生产成本较高，产量较低而在使用中受到限制。鸡卵黄抗体(IgY)作为一种免疫球蛋白，和血清抗体(IgG)的功能相似，但生产成本较低，易于大量生产，有望开发为一类可替代抗生素的高效生物防治制剂。 本研究在用大肠杆菌油佐剂灭活苗免疫蛋鸡获得卵黄抗体后，分别用微量凝集法和琼脂扩散法检测卵黄抗体中抗体的效价，比较两种方法测定结果的差异。实验结果表明，两种方法均可以用于卵黄抗体效价的检测，琼脂扩散法测定的结果比微量凝集法测定的结果高两个滴度，但微量凝集法更方便、快捷。在此基础上用微量凝集法定期检测经大肠杆菌四价(K88、K99、987P、F41)灭活疫苗免疫的蛋鸡血清抗体和卵黄抗体的效价。结果表明，血清抗体比卵黄抗体出现早，免疫蛋鸡血清中和卵黄中四种抗体的消长规律基本相似，但不同抗体水平之间存在一定的差异。整个实验期间血清抗体水平均比卵黄抗体水平高。 通过ETEC对仔猪小肠上皮细胞的黏附和黏附抑制试验，表明经多次免疫后获得的高效价卵黄抗体能有效地阻止ETEC对仔猪小肠上皮细胞的黏附。实验中，黏附组单个细胞黏附的K88+菌数平均为24.58个；而经卵黄抗体(效价为24)处理过的黏附抑制组单个细胞黏附菌数平均为0.276个。充分证实了卵黄抗体对防治仔猪腹泻的临床应用价值。 为了进一步增强卵黄抗体的作用，本研究结合鸡蛋清中的卵清溶菌酶和利用DNA重组技术在蛋清中表达的人溶菌酶来提高防治效果。研究表明，人溶菌酶在鸡蛋清中的表达量最高可达1mg/ml，表达持续时间为9-10d，具有产业化开发的价值。通过设计不同的实验组，排除了人溶菌酶的表达与卵黄抗体效价的相互影响，为防治仔猪腹泻的复合强化型全蛋粉的研究、开发与应用提供了科学依据。

目录

符号说明

文献综述

研究内容一：两种方法检测卵黄抗体效价的比较

研究内容二：鸡抗猪大肠杆菌血清抗体和卵黄抗体动态变化规律及其相互关系的研究

研究内容三：重组人溶菌酶在鸡蛋清中的表达与卵黄抗体效价相互关系的研究

研究内容四大肠杆菌多价卵黄抗体体外抑制细菌黏附作用的研究

结论

参考文献：

致谢