水稻多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因(Ospgip1)克隆与表达

摘要

植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是一种能够特异性识别和结合真菌内切多聚半乳糖醛酸酶(PG)并抑制其活性的蛋白，其富含亮氨酸重复(LRR)，在植物抗真菌过程中发挥重要作用。
　　 本研究以水稻品种Lemont、Jasmine85和YSBR1为材料，克隆水稻PGIP基因(Ospgip1)，并进行原核表达，同时明确OsPGIP1对水稻纹枯病菌PG的抑制活性。另外，通过荧光定量PCR，分析Ospgip1在水稻不同抗、感纹枯病品种中的时空表达，以及黄化处理和病菌侵染对Ospgip1的诱导表达，从而探明PGIP表达量与品种抗病性的关系。具体结果如下：
　　 1、通过PCR技术，克隆获得Ospgip1基因。该基因全长为1184 bp，具有930 bp的完整开放阅读框(ORF)，终止密码子为TAA，无内含子。生物信息学分析表明，OsPGIP1由309个氨基酸组成，含9个LRR重复，1个疏水性N端信号肽；二级结构LRR区含有α-螺旋和β-折叠各9个，分别位于LRR首尾，此外，不规则盘绕(卷曲)占有较高比例(53％)；三级结构倾向于产生纤维状构象。
　　 2、RT-PCR研究表明，Ospgip1在水稻抗、感纹枯病品种中均能表达，但在不同生育期、不同部位是否表达则有差异。根据Real Time PCR测定，水稻抗病品种YSBR1和Jasmine85中Ospgip1的表达量要明显高于感病品种Lemont，表明Ospgip1表达与品种抗病性有一定关系。
　　 3、Real Time PCR研究显示，稻苗黄化处理后，无论是抗病品种还是感病品种的Ospgip1表达均显著提高。但是，纹枯病菌侵染使得抗病品种Ospgip1表达量大大增加，而对感病品种影响不大。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

一、植物抗病分子机制

(一)植物抗病类型

(二)植物抗病基因及识别

(三)植物防卫基因及防卫反应

(四)植物抗病信号传导

二、植物抗病基因工程

(一)外源基因转化

(二)内源基因修饰和诱导

(三)转基因方法

三、植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)及其基因

(一)PGIP结构及理化特性

(二)PGIP抗病功能及机制

(三)PGIP含量与分布

(四)PGIP基因及其表达

(五)PGIP在植物抗真菌基因工程中的应用

(六)水稻PGIP及其基因

四、本研究目的和意义

材料与方法

一、供试植株

二、供试菌株

(一)水稻纹枯病菌

(二)大肠杆菌

三、质粒载体

四、试剂和仪器

(一)主要试剂

(二)主要仪器

五、水稻基因组DNA提取

(一)DNA提取(CTAB法)

(二)DNA纯度和浓度测定

六、水稻Ospgipl基因克隆与序列分析

(一)引物设计

(二)PCR扩增

(三)PCR产物纯化

(四)重组质粒构建

(五)感受态细胞制备与转化

(六)重组子酶切验证

(七)测序

(八)生物信息学分析

七、水稻Ospgip1基因的时空表达

(一)总RNA提取

(二)反转录PCR(RT-PCR)

(三)荧光定量PCR(Real Time PCR)

八、水稻Ospgip1基因的诱导表达

(一)黄化处理

(二)病菌接种

结果与分析

一、水稻Ospgip1基因的克隆与序列分析

(一)基因组DNA提取

(二)Ospgip1基因克隆

(三)Ospgip1序列分析

二、水稻Ospgip1基因的时空表达

(一)不同品种、不同生育期、不同部位Ospgip1的表达

(二)不同品种、不同生育期茎部Ospgip1表达量的差异

三、水稻Ospgip1基因的诱导表达

(一)黄化处理对Ospgip1表达的诱导

(二)纹枯病菌侵染对Ospgip1表达的诱导

讨论

一、水稻Ospgip1基因及其产物的特征

(一)序列与结构

(二)系统进化

二、水稻Ospgip1基因的表达

(一)时空表达

(二)诱导表达

三、水稻Ospgip1基因的功能

四、Ospgip1基因在水稻抗病育种中的利用

参考文献

附录

致谢