关于水稻浆片调节颖花开放机理的分子生物学基础研究

摘要

水稻颖花开放是浆片膨胀所致，与呼吸作用有关，并受多种因素的影响。本文以籼稻Ⅱ-32B不同时期的浆片为材料，利用蛋白组学技术、电镜细胞化学方法和蛋白酪氨酸磷酸化免疫印迹分析方法，研究水稻开花前后浆片中蛋白质组的变化、Ca2+的时空分布特征及蛋白酪氨酸磷酸化水平的变化，探讨水稻浆片调节颖花开放的机理。研究主要结果：
　　 (1)水稻浆片调节颖花开放机理的蛋白组学研究
　　 胶体考染染色后对水稻浆片花前1天，临开花，花后5～20min(内外稃张开过程中)三个时段的电泳图谱用PDQues软件，分别检测到蛋白点数为192、198、212。以花后5～20min为对照，花前1天和临开花分别匹配到的蛋白质点分别为159和182。
　　 13个差异显著而稳定的蛋白串联质谱结果分别为：液泡ATP合成酶催化亚基A、液泡酸性转化酶、醛缩酶C-1、磷酸丙糖异构酶、蔗糖合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、β-D-木糖苷酶、微管蛋白β-1链、微管蛋白β-3链、可逆糖基化多肽-1、延伸因子EF1B。
　　 临开花阶段，浆片细胞中与糖酵解有关的3个关键酶：醛缩酶C-1、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶表达丰度显著上升，表明临近开花时浆片细胞内的糖酵解活跃；液泡酸性转化酶在临开花和开花后5～20min中出现，它催化蔗糖水解生成葡萄糖与果糖，和糖酵解的各种中间产物一起提高了细胞的渗透势；液泡ATP合成酶催化亚基A在临开花阶段的高表达，为囊泡运输、水解酶活化、膜转运和多膜体结构的形成等过程有关，并提供最佳的PH，建立H+的跨液胞膜电化学梯度，进而调节液泡的渗透压和液泡膜的透性；β-D-木糖苷酶在临开花阶段的活性加强有利于细胞壁的降解和松弛；微管蛋白在临开花时表达下调表明：临近开花，浆片细胞的体积增加没有或极少有新壁物质的积累，同时也说明它与浆片细胞的膨胀关系不大。
　　 (2)水稻颖花开放前后浆片Ca2+的细胞化学定位
　　 用焦锑酸钙沉淀法显示水稻颖花开放前后Ca2+沉积的时、空动态差异。水稻颖花在开花前1天，Ca2+大量沉积出现在导管腔和细胞间隙中。临开花时，除导管腔内仍大量存在外，浆片薄壁细胞膜上已附着有大量的Ca2+沉积，且细胞核、质膜、线粒体、内质网上也有分布。开花后至内外稃张角最大时，Ca2+明显向细胞内移动，内质网、线粒体、液泡膜上都附着了大量的Ca2+沉积。随着颖花的关闭和浆片的萎缩，大量携带着Ca2+沉积的内质网移向线粒体等细胞器内形成降解小泡，原有沉积较多Ca2+离子的线粒体已降解成空泡。花后3h，浆片细胞内物质被撤离，细胞皱缩，含Ca2+多膜小体仍残留其中。该结果表明浆片的膨胀和萎缩与Ca2+在浆片中时、空动态变化有关。
　　 (3)水稻颖花开放前后蛋白酪氨酸磷酸化的免疫印迹分析
　　 利用酪氨酸磷酸化多克隆抗体进行免疫印迹分析水稻颖花开放前后蛋白酪氨酸磷酸化水平。研究表明，水稻浆片分子量在44.2、27.1、26.1、22.6、20.9、19.9、18.7和17.0KD蛋白磷酸化，到了临开花阶段27.1、26.1、18.7KD蛋白发生了一定程度的脱磷酸化，在花后17.0 KD也发生了一定程度的蛋白脱磷酸化，说明酪氨酸磷酸化存在于浆片体内。在水稻颖花开放过程中，蛋白酪氨酸可逆磷酸化参与了浆片的膨胀运动。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一章文献综述

1.1水稻颖花开放机理研究进展

1.1.1水稻小穗的结构

1.1.2水稻的开颖过程

1.1.3水稻的开花习性和诱导因子

1.1.4浆片在颖花开放过程中的作用及膨大机理

1.1.5水稻颖花开放机理

1.2蛋白质组学研究技术概况及其在水稻中的应用

1.2.1蛋白组学的概念及其发展的原因

1.2.2蛋白组学研究的技术流程

1.2.3蛋白组学在水稻中的应用

1.3植物钙信号和蛋白磷酸化的研究概况

1.4本实验的研究目的及意义

第二章水稻浆片调节颖花开放机理的蛋白组学研究

2.1材料与方法

2.1.1实验材料与材料种植

2.1.2实验方法

2.2结果与分析

2.2.1 2-DE凝胶图谱分析

2.2.2差异蛋白点MALDI-TOF-TOF/MS鉴定与数据库比对结果

2.2.3差异蛋白功能分析

2.3讨论

2.3.1能量代谢上的适应性反应

2.3.2渗透压的调节

2.3.3细胞壁重塑与松弛

2.3.4细胞骨架的动态变化

2.3.5蛋白合成速度加剧

2.3.6其它方面的适应性反应

第三章水稻颖花开放前后浆片Ca2+的细胞化学定位

3.1材料与方法

3.1.1实验材料与材料种植

3.1.2实验方法

3.2结果与分析

3.3讨论

第四章水稻颖花开放前后磷酸酪氨酸蛋白的免疫印迹分析

4.1材料与方法

4.1.1实验材料与材料种植

4.1.2实验方法

4.2结果与分析

4.2.1水稻颖花开放前后浆片总蛋白的SDS-PAGE

4.2.2水稻颖花开放前后浆片磷酸酪氨酸的免疫印迹分析

4.3讨论

参考文献

附录

致谢