异孢镰孢毒素的分离纯化及其生物活性研究

摘要

异孢镰孢是空心莲子草的病原真菌,毒素也有致病作用。本文对毒素的纯化、毒素及其成分的生物活性以及毒素的稳定性等开展了研究。
　　 1.在毒素生物活性测定中比较了叶碟法、针刺法和刀切伤口法,结果表明,固体培养物粗毒素2.0-5.0g/L处理后72h,叶碟法测定的校正病情指数则到65.29-77.75,针刺法的校正病情指数为44.97-65.12,刀切伤口法的校正病情指数为61.07-74.81。液体培养物粗毒素2.0-5.0g/L处理后72h,叶碟法的校正病情指数达到76.58-85.81,刀切伤口法的校正病情指数为70.68-81.96。表明叶碟法和刀切伤口法适合异孢镰孢毒素的活性测定,而对于毒素组分则用刀切伤口法更好。
　　 2.用萃取法和活性炭吸附法从去菌培养滤液中得到异孢镰孢粗毒素,并用生物测定方法确定各提取方法所得到的粗毒素的活性。结果表明,用正丁醇萃取法和活性炭吸附法得到的粗毒素生物活性最高,处理后72h空心莲子草叶碟的校正病情指数分别达76.69和74.11,与培养滤液处理相比,相对活性指数达到85.55％和82.66％,而用石油醚萃取的粗毒素则活性最低,表明异孢镰孢毒素的主要生物活性成分是具有极性的。
　　 3.采用柱层析法对粗毒素进行纯化,得到了3个组分,其中对组分Ⅰ进行2次纯化后,得到了具有生物活性的组分Ⅰ-2-2,生测结果表明,2.0g/L的组分Ⅰ-2-2处理后72h对寄主叶片的校正病情指数达到85.55;对组分Ⅰ-2-2进行官能团初步鉴定,认为此组分不属于酚类、酯类、生物碱、糖类以及氨基化合物;此组分通过紫外-可见全波长扫描,表明其在220nm处有最大吸收峰,高效液相色谱分析表明它有两个主要特征峰,保留时间分别是2.740min与4.800min。
　　 4.用分光光度法测定了异孢镰孢培养不同时间培养液中葡萄糖和蛋白质浓度的变化动态,并通过生物测定方法研究病原菌毒素的产生动态。结果表明,异孢镰孢培养15天对葡萄糖的利用率较低,而对蛋白质消耗大,培养滤液的生物活性低,表明毒素产生少;在20d-30d,葡萄糖利用率直线上升,培养液中的蛋白质浓度显著增加,培养滤液的生物活性显著增强,显示毒素产生增加明显;在培养30天后则趋向稳定。
　　 5.采用生物测定方法研究了温度、贮存时间、光照时间、pH值对粗毒素稳定性的影响,结果表明,120℃处理后粗毒素对寄主叶碟的校正病情指数(76.17)与0℃处理的(78.21)无显著差异;异孢镰孢粗毒素室温下贮存360d,寄主叶碟的校正病情指数为77.45,与室温贮存5d的(78.21)无显著差异,粗毒素25℃连续光照30d处理的寄主叶碟的校正病情指数为76.17,与光照1d的(77.45)无显著差异,溶液pH值的改变对粗毒素生物活性的影响也不显著,表明毒素中活性成分的稳定性好。