钙离子在镉致体外培养大鼠大脑皮质神经细胞凋亡中的作用

摘要

为探讨钙离子(Ca2+)在镉致大鼠大脑皮质神经细胞凋亡中的作用,本研究用孕18-19d SD大鼠的胎鼠建立了大脑皮质神经细胞的模型,观察不同时期的细胞形态,NSE免疫组化法鉴定细胞纯度。在细胞培养液中添加不同浓度的醋酸镉(0、5、10、20μmol/L)以及10μmol/L细胞内Ca2+螯合剂BAPTA-AM,使其单独或联合作用于细胞12h,观察镉对细胞的形态学损伤;利用MTT法测定镉及BAPTA-AM对细胞存活率的影响;利用流式细胞仪测定细胞凋亡率、细胞内Ca2+浓度、ROS水平、线粒体膜电位(△ψm);荧光定量PCR法测定钙调蛋白(CaM)Mrna表达;分光光度计法测定细胞膜ATPase的活力。结果表明:①神经细胞培养至第六天形态最佳、活力最强,是用于进一步实验的最佳时期;NSE纯度鉴定结果表明,培养至第六天的细胞纯度可达95％以上。②镉暴露引起细胞形态的变化,使胞体变小,网络消失;影响细胞核的形态,产生凋亡小体。上述变化呈现一定剂量—效应关系。③镉暴露可使细胞存活率降低,BAPTA-AM联合组与相应染毒组比较,细胞存活率呈现上升趋势。④细胞凋亡率随染毒浓度的增加呈上升趋势,BAPTA-AM联合组与相应染毒组相比均呈下降趋势;⑤细胞内Ca2+浓度随染毒浓度的增加显著或极显著升高(P＜0.05或P＜0.01),BAPTA-AM联合组与相应染毒组相比均呈降低趋势,10μmol/L组差异极显著(P＜0.01),20μmol/L组差异显著(P＜0.05);⑥细胞内ROS水平升高,随染毒浓度的增加呈降低趋势,但仍显著高于对照组(P＜0.05),BAPTA-AM联合组与相应染毒组比较,细胞内ROS水平均明显降低,其中5μmol/L组差异显著(P＜0.05),10μmol/L组差异极显著(P＜0.01)。⑦线粒体膜电位随染毒浓度的增加呈降低趋势,10μmol/L组表现极显著(P＜0.01),20μmol/L组差异显著(P＜0.05),BAPTA-AM联合组与相应染毒组比较呈现升高趋势,其中20μmol/L组差异极显著(P＜0.01);⑧细胞膜ATPase活性随染毒浓度的增加呈现显著或极显著的下降(P＜0.05或P＜0.01),与20μmol/L,染毒组相比,BAPTA-AM联合作用组Na+-K+-ATPase活性显著升高(P＜0.05),Ca2+-Mg2+-ATPase活性极显著升高(P＜0.01);⑨与对照组相比,20μmol/L组CaM Mrna表达极显著降低(P＜0.01),其余无明显变化,BAPTA-AM联合组与相应染毒组比较,20μmol/L组极显著升高(P＜0.01),其余无明显变化。
　　 结论:①不同浓度镉暴露可降低神经细胞存活率,损伤细胞形态;②不同浓度镉暴露可使细胞凋亡率升高,细胞内Ca2+浓度升高,ROS水平升高,△ψm降低,细胞膜ATPase活性降低,CaMmRNA表达量降低;③加入BAPTA-AM后,可明显缓解镉引起的各项指标的变化,提示细胞内钙超载在大脑皮质神经细胞凋亡过程中发挥重要作用。