百日咳杆菌CpG-ODNs对变应性哮喘小鼠Toll信号分子的实验研究

摘要

变应性哮喘是以IgE过量合成、嗜酸性粒细胞和肥大细胞浸润、气道高反应性及气道重塑为主要特征的慢性气道炎症。哮喘发病率逐年上升，严重影响患者日常生活，有时甚至是致命的。近年来研究发现，变应性哮喘是一种Th1/Th2反应失衡的呼吸道疾病，哮喘病程中，Th2反应占主导作用，产生Th2类细胞因子从而阻抗Th1反应，介导了嗜酸性粒细胞炎症及B细胞分泌IgE过程，调节Th1/Th2平衡调控哮喘已成为公认的治疗方法。
　　 百日咳杆菌为一类致病微生物，可诱发百日咳疾病。近年来医学工作者将灭活百日咳杆菌疫苗，白喉疫苗及破伤风疫苗合用形成百白破联用疫苗，以预防这三类疾病。也有研究发现灭活百日咳杆菌为一种Th1反应刺激剂，可产生防治变应性疾病作用。进一步研究发现灭活全细胞百日咳杆菌对小鼠变应性哮喘具有治疗作用，这可能与其中包含抗变应性哮喘活性的CpG-ODNs有关。
　　 非甲基化含CpG基序寡核苷酸单链(unmethylated CpG motif containingoligo deoxy nucleotides，简称CpG-ODNs)为一类具有抗变应性疾病活性的DNA序列。目前研究发现4种亚型，即A型-D型。脊椎动物含有无活性的甲基化CpG-ODNs，无脊椎动物含有有活性的非甲基化CpG-ODNs。CpG-ODNs进入机体后，以胞吞作用进入细胞，与细胞内体中TOLL样受体-9(TLR-9)结合，激活TLR共刺激通路，诱导核因子(AP-1，NF-kappaB)转录，促进Th1细胞因子合成，抑制Th2型细胞因子分泌，使哮喘中失衡的Th1/Th2反应恢复平衡，产生调节变应性哮喘作用。
　　 前期研究主要涉及给予变应性哮喘小鼠灭活百日咳杆菌，对其调节变应性哮喘机制进行评价。结果发现给药后哮喘小鼠BALF中炎症细胞数下降，且外周血中IL-4/IFN-γ恢复平衡，具有一定调节变应性哮喘机制的作用，这种作用可能由菌体内的CpG-ODNs产生，但对百日咳杆菌CpG-ODNs防治哮喘的机制研究未见报道。本研究基于前期研究，应用软件获取9条百日咳杆菌CpG-ODNs，进行抑制炎症细胞反应实验，筛选出抑制炎症细胞最佳CpG-ODNs序列seq A。后续研究中应用seqA给予OVA致敏小鼠慢性哮喘模型，检测其对变应性哮喘小鼠肺泡灌洗液(BALF)中Th1/Th2细胞因子(IFN-γ/IL-4)及血管内皮生长因子(VEGF)产生量的影响，并通过RT-PCR和western blot法分别检测小鼠脾细胞TLR-9 mRNA及肺组织TLR-9蛋白表达量。结果发现，seq A抑制炎症细胞效果最佳，其能够提高小鼠慢性哮喘模型BALF中IFN-γ含量，抑制IL-4含量；但对VEGF作用并不明显。且其能够有效上调小鼠脾细胞TLR-9 mRNA和肺组织TLR-9蛋白表达量，所有实验组中腹腔注射(ip)组均优于灌胃(ig)组。结果表明，百日咳杆菌CpG-ODNs具有抑制炎症细胞活性，seq A能够有效调节Th1/Th2反应，且其对TLR-9具有上调作用，证明这种活性与激活TLR-9信号通路有关，实验发现给予CpG-ODNs时ip途径优于ig途径。