E.coliF18敏感型和抵抗型断奶仔猪十二指肠差异miRNAs的筛选及验证分析

摘要

断奶仔猪腹泻和水肿病是两种导致断奶仔猪死亡的重要传染性疾病，对养猪业造成了巨大的经济损失。大肠杆菌F18菌株是引起这两种疾病的主要病原菌，本试验对大肠杆菌F18菌株敏感型和抵抗型断奶仔猪全同胞配对组中每个个体十二指肠内的小RNA文库进行测序，筛选差异miRNA，对其进行实验验证并开展靶基因的预测分析，以期为增加猪miRNA数据库信息、了解中国地方猪种与外来猪种抗大肠杆菌F18菌株的遗传基础差异以及寻找抗大肠杆菌F18菌株感染的新标志物提供一定的依据。主要试验结果如下:
　　 1.运用V型分泌系统展呈功能性黏附素和受体结合试验技术，在体外精确确定仔猪细菌性腹泻和水肿病病原菌黏附素与仔猪肠上皮细胞相互作用，并运用到大肠杆菌病抗性和敏感性个体的鉴定和验证中，断奶仔猪的小肠上皮细胞如均能与表达F18ab菌毛标准菌株107/86、诱导表达的重组大肠杆菌rE.coli1534及诱导表达的重组大肠杆菌pnirBMisL-fedF以及987P、K88ac亚单位的重组大肠杆菌pnirBMisL-FasG、pnirBMisLFaeGfedF发生黏附作用，被判定为大肠杆菌F18菌株敏感型;如果仔猪小肠上皮细胞对3株大肠杆菌的黏附能力几乎为零，则判定为抗性型。在相同环境下饲养的苏太猪E.coliF18敏感型和抵抗型8个全同胞家系中，以极端表型（抗性和敏感）为出发点，根据上述检测及判定方法，分别从同一个家系中筛选出初生重、断奶重和体形基本一致的抗性型和敏感型全同胞个体各1个，组成配对实验组，对十二指肠组织进行差异miRNA筛选，所得到的结果更具有针对性和参考价值。
　　 2.运用IlluminaSolexa测序技术对E.coliF18敏感型和抵抗型对比组所有个体进行测序，每个个体均获得两千多万条序列信息，将E.coliF18敏感型与抵抗型两组数据进行比较，共发现58个差异miRNA，其中上调46个，下调12个，序列计数（即表达量）平均值大于10000条的差异miRNA有ssc-mir-143、ssc-let-7f、ssc-mir-192、ssc-mir-21、ssc-mir-215和ssc-mir-378。对所有差异miRNA前体序列分析后发现，前体序列位于基因序列内的miRNA有14条，前体序列位于基因序列间的miRNA有45条。构建差异miRNA前体与转录因子结合网络——TF-Gene-Network，网络中单一miRNA前体最多受到了3个转录因子的调控，均为上调表达的差异miRNA。对差异miRNA靶基因与表达谱差异基因交集基因Goontology分析及网络构建(miR-GO-Network)，这些差异表达的miRNA对应靶基因主要涉及细胞黏附(celladhesion)、转录调控(positiveregulationoftranscription)、细胞凋亡的调控（positiveregulationofapoptosis）以及对脂多糖的应答(responsetolipopolysaccharide)等多个方面。
　　 3.结合可能与E.coliF18感染相关的生物学功能，对所有上下调差异miRNA对应靶基因的显著性功能分析结果进行进一步筛选，得到53个显著性GO，与差异miRNA构建miRNA-GO-Network，筛选出在两组样本中关键的差异miRNA以及这些miRNA所调控的靶基因的主要功能。同时，利用图论的方法对网络中的差异miRNA和GO在网络中的调控地位进行评价，得到关键的差异miRNA和GO。分析结果显示，这些差异表达的miRNA对应靶基因主要参与了免疫应答的各种通路。利用miRNA与靶基因之间的调控关系，构建miRNA-Gene-Network，同时，利用图论的方法对网络中miRNA在网络中的调控地位进行评价，结合E.coliF18的致病机制以及个体感染后引起的免疫应答反应，同时参考前期与猪相关的miRNA研究报道，获得12个关键差异miRNA，包括11个上调的差异miRNA，包括ssc-mir-143、ssc-let-7f、ssc-mir-30e、ssc-mir-148a、ssc-mir-148b、ssc-mir-181a、ssc-mir-192、ssc-mir-27b、ssc-mir-15b、ssc-mir-21、ssc-mir-215，和1个下调的差异miRNA:ssc-mir-152。
　　 4.由于ssc-mir-30e、ssc-mir-148b和ssc-mir-181a没有对应的商业化TaqManmiRNAAssays定量试剂盒，对剩余9个目标miRNA在扩大样本量的EcoliF18敏感组和抗性组间进行了荧光定量验证，定量结果与高通量测序结果一致。miR-215和miR-192在敏感组和抗性组之间差异极显著(p＜0.01)。另外，miR-15b、miR-152、miR-143-5p和let-7f在敏感组和抗性组之间的表达显著差异(p＜0.05)。
　　 5.通过表达谱芯片与小RNA芯片数据联配获得显著差异表达(p＜0.05)的miRNA和mRNA，筛选的mir-215对应的靶基因ALCAM、DLG5、FRMD4B、MIPOL1、ZFHX3以及mir-15b、let-7f对应的共同靶基因EGLN2、CDC14B、MAP4K3、ABL2、PRKAB2，通过种子序列验证miRNA和mRNA的对应关系，GO和KEGG通路分析得知，这些基因共同参与细胞周期、细胞骨架作用、胰岛素信号转导和MAPK信号通路过程中。

目录

第一章 文献综述

1．1 猪F18大肠杆菌抗病育种进展

1．2 miRNA

1．2．1 miRNA的形成

1．2．2 miRNA合成调控过程

1．2．3 miRNA的作用机制

1．2．4 miRNA靶基因的预测分析

1．2．5 靶基因验证

1．2．6 miRNA与疾病发生的关系

1．2．7 猪miRNA研究

1．3 本试验的目的和意义

第二章 材料和方法

2．1 主要试验仪器和材料

2．2 实验试剂

2．3 所需溶液的配制

2．3．1 粘附试验相关试剂配制

2．3．2 小RNA文库建立的试剂

2．4 试验样本

2．5 试验方法和步骤

2．5．1 仔猪小肠上皮细胞分离

2．5．2 粘附试验中使用大肠杆菌培养方法

2．5．3 重组菌与仔猪小肠上皮细胞的体外黏附试验

2．5．4 结果判定

2．6 目标miRNA在E coli F18敏感组和抗性组间的荧光定量验证

2．6．1 组织处理

2．6．2 RNA浓度和纯度检测

2．6．3 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳的检测

2．6．4 cDNA合成

2．6．5 荧光定量PCR反应体系及反应条件

2．6．6 数据处理与分析

2．7 小RNA测序文库制备

2．8 反转录及扩增(Reverse Transcribe and Amplify)

2．8．1 反转录

2．8．2 PCR扩增

2．8．3 cDNA纯化

2．8．4 测序结果数据分析

2．8．5 大肠杆菌F18菌株敏感型和抵抗型对比组差异miRNA筛选结果分析

2．8．6 图论：网络图(Network)的分析方法

2．8．7 差异miRNA靶基因的预测

第三章 结果与分析

3．1 粘附试验分析结果

3．2 大肠杆菌F18菌株敏感型和抵抗型对比组Solexa测序直接结果

3．3 大肠杆菌F18菌株敏感型和抵抗型对比组差异miRNA筛选结果

3．4 差异miRNA前体与转录因子结合网络——TF-Gene-Network

3．5 Q-PCR结果

3．6 差异miRNA靶基因与表达谱差异基因交集基因的功能分析

3．6．1 交集基因Go ontology分析及网络构建(miR-GO-Network)

3．6．2 交集基因Pathway分析

3．6．3 差异miRNA与显著性GO、显著性Pathway所属交集靶基因的分析及调控网络的构建

3．7 候选差异miRNA的确定

3．8 靶基因的分析结果

第四章 讨论

全文结论

参考文献：

致谢

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