城市污泥中环境激素4-t-辛基酚的生物降解及其固定化微生物应用

摘要

我国的污水处理研究长期存在着“重水轻泥”的现象，而有关污泥处理的报道更多关注重金属污染而轻视环境激素等有机物污染的问题。随着我国城市面积和人口的增加，社会和经济建设的不断发展，对污泥处理的量能需求将大幅增长。污泥中含有大量包括辛基酚(Octylphenol，OP)、壬基酚(Nonylphenol，NP)、双酚A(Bisphenol A)等在内的环境激素，如果不加处理任意排放或投弃，则会对环境造成严重的二次污染。
　　 辛基酚作为一种重要精细化工的原料和中间体，其生物毒性、雌激素活性及生物富集性均得到了国内外研究者的广泛证实，给人类健康和生态安全带来了巨大威胁。因此，如何有效从环境中降解并去除辛基酚等环境激素类物质，降低其对环境和人体的危害，成为国内外学者关注的焦点。
　　 由于采用生物方法处理污泥、污水中环境激素类污染物具有低成本、方便操作、去除效率较高、无二次污染等特点，是纯天然的治污技术，因此，本研究试图从生物处理的角度入手，开展生物降解菌的分离筛选研究，得到高效的辛基酚降解菌株，为辛基酚的环境污染治理与生态修复工程提供技术保证。因此，本课题具有以下几个方面的工作:
　　 (1)得到一株4-t-辛基酚(4-t-OP)有效降解菌TW30。通过对生活污水处理厂二沉池污泥样品的驯化、筛选、分离及纯化等步骤，得到了1株能够以4-t-OP为唯一碳源生长的菌株TW30，其在初始底物浓度为5 mg/L，pH值为6.0，培养温度为40℃的条件下培养5d后的降解率达到99.03％，具有很好的降解效果。
　　 (2)对降解菌TW30进行分子生物学鉴定。通过16Sr RNA鉴定，TW30为与不动杆菌属(Acinetobacter sp.)的Acinetobacter sp. JPB-1.07(EU652468)的相似性达99.9％，再结合形态、培养和生理生化特征，初步鉴定为不动杆菌属(Acinetobacter sp.)。
　　 (3)筛选出菌株TW30的最优化生长条件。从不同初始底物浓度、温度、pH值等环境影响因素，考察菌株TW30的细胞增殖率。结果显示在初始底物浓度为5 mg/L，培养温度为40℃，pH值为6.0的条件下，菌株TW30的细胞增殖率最高，而较高的初始底物浓度、较低的培养温度和碱性条件均会抑制菌株TW30的生长。此外，通过设置4-t-OP溶剂(丙酮)的对照实验，证实了菌株TW30能够利用4-t-OP为唯一碳源进行生长。
　　 (4)研究菌株TW30降解过程的降解反应动力学。根据HPLC测定的4-t-OP降解率结果进行拟合，发现降解过程满足一级反应动力学，拟合方程为y=-0.8929x+8.2202，相关系数为r2=0.9831。结果发现，在pH为6.0，初始4-t-OP浓度为5 mg/L，2％的菌投加量，于40℃下培养，4-t-OP的降解速率常数为0.875 d-1，半衰期为0.8d。
　　 (5)考察不同环境因素对菌株TW30降解效率的影响。通过测定不同底物浓度、菌投加量、温度、pH值、额外无机盐离子和碳源等条件下，每24 h的4-t-OP降解率，研究菌株TW30的4-t-OP降解动力学。在最优化条件下培养5d后的4-t-OP降解率可达到99.03％，此时培养液中的4-t-OP浓度为48.3μg/L。此外在该条件下，额外Ca2+和Mn2+的加入可以显著促进4-t-OP的降解过程，而加入磷酸盐、NH4+、Mg2+、Fe2+、Na+、Zn2+、Cu2+等无机盐和葡萄糖、CH3COO-等碳源则会降低菌株TW30的降解效果。
　　 (6)检测了4-t-OP的降解产物并推测了其降解途径。降解产物的GC-MS检测结果显示，菌株TW30对4-t-OP的降解产物是4-异丙基-甲苯、叔丁基苯和4-乙酰基苯甲酸。基于该结果推测其降解途径如下，由于苯环上羟基上的O原子有很强的吸电子的能力，会使苯环上的电子云密度降低，使得羟基容易被取代，因此，菌株TW30优先将辛基酚的酚羟基断开;此外，苯环上的烷基链断裂成若干短链烷基，与羟基自由基结合生成烷基醛或烷基酸。由于没有检测到辛基苯或其他更小碳链的烷基苯酚，因此，菌株TW30降解4-t-OP的途径可能为苯环与羟基间和与长碳链间的共价键同时断裂，并在断开后重新组合，成为自由活化基团，进行重新组合后生成了烷基苯、短链烷基酚、对乙酰基苯酚、烷基酸、烷基醛等中间产物，并进而反应生成4-异丙基-甲苯、叔丁基苯和4-乙酰基苯甲酸。
　　 (7)考察了固定化微生物技术对4-t-OP降解效率的影响。研究菌株TW30在不同固定化细胞株浓度、pH值等条件下的4-t-OP降解降解率。结果显示，固定化细胞株处理的半衰期为0.7d，降解速率常数为0.975 d-1，降解效果好于最优化条件下的菌悬液对照。而增大固定化细胞株浓度并维持培养液pH为6.0可以达到最佳降解效果。
　　 (8)将菌株TW30的固定化细胞株应用于人工海水和生活污水中4-t-OP的降解。配制了人工海水、采集了生活污水，TW30的固定化细胞株可以在这两种自然条件下对4-t-OP进行有效的降解，其降解速率常数分别达到了1.257 d-1和1.305 d-1，半衰期分别为0.5d和0.4d。由于该方法操作简便，反应条件温和，对微生物细胞活性影响较小，有较高的细胞容量，采用此方法制作的固定化细胞株机械强度高，稳定性好，细胞不易渗漏，因此在土壤修复和污水处理等环保治理措施方向具有很大的应用价值。
　　 通过本课题的研究，获得了1株高效4-t-OP降解菌株，并掌握了其降解4-t-OP的相关规律，为4-t-OP污染的环境治理和生态修复工作提供了有力的技术支持，具有极其重要的环保意义和社会意义。

目录

1 绪论

1．1 研究背景

1．1．1 我国城市污泥的污染现状

1．1．2 我国城市污泥的资源化利用

1．2 环境激素

1．2．1 环境激素简介

1．2．2 环境激素的分类

1．2．3 环境激素的危害

1．3 辛基酚及其环境行为

1．3．1 辛基酚的性质和检测方法

1．3．2 环境中辛基酚的来源

1．3．3 辛基酚的去除方法

1．4 辛基酚的生物降解

1．4．1 辛基酚的生物降解途径

1．4．2 辛基酚生物降解的影响因素

1．5 本课题研究工作

1．5．1 研究背景及意义

1．5．2 研究内容

1．5．3 技术路线

2 4-t-OP降解菌的分离、筛选和鉴定

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验仪器与材料

2．2．2 实验方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 4-t-OP降解菌筛选条件和操作方法

2．3．2 4-t-OP降解菌的鉴定

2．3．3 菌株TW30的最适生长条件

2．4 本章小结

3 4-t-OP降解菌的降解动力学分析

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验仪器与材料

3．2．2 实验方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 降解动力学分析

3．3．2 降解产物分析

3．4 本章小结

4 固定化菌株的应用

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验仪器与材料

4．2．2 实验方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 固定化细胞株的降解效果

4．3．2 固定化细胞株的降解动力学分析

4．4 本章小结

5 结论

附表

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录

声明