新城疫病毒P基因编码蛋白拮抗Ⅰ型干扰素信号通路的机制研究

摘要

新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)强毒株引起的烈性、高度接触性传染病，在世界范围内流行，感染多种禽类，给养禽业造成巨大经济损失。NDV基因组结构为3'-NP-P-M-F-HN-L-5'，其中P基因能通过“RNA编辑”产生结构蛋白P及非结构蛋白V和W，P/V/W蛋白具有相同的氨基端和不同的羧基端。NDV V蛋白被认为是毒力因子之一，与其IFN通路拮抗能力有关，也与NDV溶瘤特性相关。
　　目前关于NDVV蛋白拮抗IFN信号具体机制的研究尚不多见，有研究表明V蛋白能通过降解STAT1(Signal transducer and activator of transcription1，STAT1)发挥阻断IFN信号的作用。然而另一研究结果发现，在NDV感染细胞及V蛋白过表达细胞系中，STAT1蛋白能与V蛋白共存，暗示存在其他的IFN信号阻断机制。为了进一步研究V蛋白拮抗IFN信号的具体机制，本文通过多种NDV毒株感染多种细胞，以及NDV真核表达质粒转染等技术手段，检测IFN信号通路中关键蛋白的表达水平及磷酸化修饰水平，鉴定与之相关的病毒蛋白，阐明其作用机制。最终，利用V蛋白缺失株ZJ1-Vs对实验结果进行验证。本研究的结果为NDV P基因编码蛋白P/V/W在拮抗Ⅰ型IFN信号通路中的功能提供了新的见解。
　　1.三种基因型NDVP/V/W真核表达质粒构建及多克隆抗体的制备
　　为获得检测V蛋白表达的抗体，本研究通过扩增NDV9a5b毒株V蛋白PNT结构域和CTD结构域，以及ZJ1毒株V蛋白CTD结构域，连入原核表达载体pET-28a或pColdTF进行原核表达，蛋白纯化后免疫小鼠，获得9a5b V蛋白和ZJ1 VCD多克隆抗体。同时利用Overlapping PCR构建了9a5b、La Sota和ZJ1毒株V和W蛋白真核表达质粒。结果显示，9a5b V蛋白多抗和ZJ1 VCD多抗反应性良好，可用于V蛋白表达检测。9a5b、La Sota和ZJ1毒株V和W蛋白真核表达质粒也构建成功并正确表达。NDV感染人源细胞系HeLa和禽源细胞系DF1后V蛋白表达存在宿主差异，易感宿主鸡源DF1细胞中V蛋白表达量更高，而在哺乳动物细胞中，V蛋白并不能有效表达。
　　2.NDV V蛋白介导STAT1降解的毒株差异分析
　　为验证NDV对IFN信号通路中关键蛋白STAT1的作用，本实验使用9a5b、La Sota和ZJ1等NDV毒株感染和V蛋白真核表达质粒转染HeLa和Vero细胞。Western-blot检测相关蛋白的表达水平，比较转染、感染单一作用或共同作用下，细胞内STAT1的变化水平。结果发现，NDV感染HeLa和Vero细胞STAT1降解不明显，转染V蛋白后也得到同样的结果。有趣的是，只有在转染V蛋白后感染NDV，STAT1才出现明显的降解，且不同毒株之间存在差异。该结果表明，V蛋白对STAT1的降解作用受到毒株差异、感染后细胞生物学活动变化或其他病毒蛋白的影响。
　　3.NDVP基因编码蛋白对STAT1磷酸化水平的影响及反向遗传毒株验证
　　根据上述实验结果，我们推测V蛋白可能通过其他途径间接地诱导STAT1蛋白的降解。众所周知，STAT1蛋白磷酸化是IFN信号通路激活的重要环节。为验证V蛋白是否与磷酸化STAT1(p-STAT1)相互作用，本研究通过外源IFN-α刺激，NDV感染及真核表达质粒转染，泛素抑制剂处理，并最终通过反向遗传V蛋白缺失株ZJ1-Vs验证，NDV V蛋白通过针对性介导p-STAT1蛋白发生泛素蛋白酶体依赖的降解来发挥拮抗IFN信号的作用，同时还发现一些毒株P和W蛋白也具有V蛋白样功能。此外，IFN-γ刺激实验显不，NDV无法抑制IFN-γ诱导的p-STAT1产生，表明NDV能拮抗Ⅰ型IFN信号而不影响Ⅱ型IFN系统。
　　本研究阐明了NDV拮抗IFN信号通路的具体机制，同时首次发现NDV P基因编码蛋白P/V/W蛋白具有相似的功能，为研究NDV逃避先天性免疫反应机制打开了新的视野和思路。