弓形虫SAG1蛋白的原核表达及其初步应用

摘要

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)为细胞内寄生原虫，能感染许多家畜、野生动物和人类。孕妇感染弓形虫后容易造成流产、胎儿畸形甚至死胎。因此，从优生学角度出发，孕妇产前弓形虫检测有着重大意义。免疫酶联吸附反应(ELISA)方法具有敏感度高，特异性强等优点，而且能定量检测，被广泛应用于疾病的诊断方面;胶体金法具有特异性强、操作简便、出结果早、费用低、无需专业技术与设备等优点，目前的应用范围也日益扩大。但是由于目前常采用组织培养的弓形虫速殖子提取抗原做血清学检测，其结果有时会出现假阴/阳性，给实验室诊断带来很多不便。为了提高血清学诊断的敏感性和特异性，唯一可行的方法是用纯化的重组抗原。
　　研究目的:利用基因重组技术制备弓形虫表面抗原SAG1，用于弓形虫感染的免疫学诊断。
　　研究方法:利用GeneBank中公布的SAG1序列，用DNAstar软件自行设计引物，进行聚合酶链式反应(PCR)扩增SAG1序列，NdeI、XhoI双酶切SAG1和质粒pCold-TF，用T4连接酶将质粒和SAG1片段连接过夜，构建pCold-TF/SAG1重组质粒。再将重组质粒pCold-TF/SAG1转化进大肠杆菌DH5α，提取质粒双酶切鉴定，核酸测序验证。将验证的重组质粒DNApCold-TF/SAG1转化入大肠杆菌BL21(DE3)，用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达，取上清通过SDS-PAGE电泳验证，再通过His标签亲和纯化，获得可溶性蛋白TF/SAG1，用酶联免疫吸附试验(ELISA)和金标技术（捕获法、双抗原夹心法）鉴定，纯化TF/SAG1用做诊断抗原的ELISA检测412例人血清，并用商品试剂盒做了比较。
　　研究结果:①用PCR成功扩增SAG1基因。②成功构建质粒pCold-TF/SAG1。③获得重组蛋白TF/SAG1。④重组蛋白TF/SAG1具有特异性。
　　研究结论:重组蛋白TF/SAG1能用作弓形虫感染的诊断抗原。