水稻OsGLO5和OsCATA基因对光呼吸代谢的影响

摘要

光呼吸途径是植物体内重要的碳素代谢途径，也是重要的能量代谢途径。光呼吸代谢通过消耗光合作用中间产物、影响植物体内氮素代谢或积累光呼吸途径中间产物等抑制光合作用，降低卡尔文循环固定CO2的量。通过抑制光系统D1蛋白的合成阻止PSII损伤的修复，同时由于光呼吸代谢可以影响光合作用固定CO2的量，从而引起光能的吸收和利用之间的失衡，过多的光能使光系统产生过量的活性氧影响光呼吸和光系统。光呼吸途径在过氧化物酶体中产生的H2O2，不仅具有细胞毒性，同时也是细胞内的氧化还原信号，甚至能引起细胞的程序性死亡。本实验构建水稻光呼吸途径OsGLO5基因干扰载体转化水稻，分析OsGLO5基因对光呼吸代谢、卡尔文循环、光系统和抗氧化系统的影响;利用OsCATAi转基因水稻分析OsCATA基因对光呼吸代谢、卡尔文循环、光系统和抗氧化系统的影响;通过改变CO2和O2的比例，分析不同浓度CO2和O2处理对光呼吸代谢、卡尔文循环、光系统和抗氧化系统的影响。结果表明:
　　1.从水稻cDNA中扩增出OsGLO5基因一段404 bp的序列用于构建干扰载体，测序结果与水稻数据库中的序列同源性100％，该段序列跨OsGLO5基因第2、3、4、5、6和7共六个外显子，其中第2和第7外显子只含有一段序列。构建了UBi-1启动子调控的OsGLO5基因干扰载体，该载体含有由35S启动子控制的GUS基因和潮霉素基因。通过农杆菌介导的方法将OsGLO5i载体和不带有干扰片段的空载体转化日本晴。
　　2.通过GUS染色、提取DNA、定量PCR、Western blot和酶活性测定等鉴定和分析转基因水稻，GUS染色鉴定和提取T2代水稻DNA并进行PCR鉴定，获得转基因水稻纯合株系，共获得转空载体水稻一个株系，OsGLO5i转基因水稻两个株系。与日本晴相比OsGLO5i转基因水稻定量PCR分析显示OsGLO5基因表达下降到20％和17％;Western blot分析显示OsGLO蛋白含量下降到61％和67％，GLO活性下降到54％和48％。同时OsGLO1、OsGLO2和OsGLO3基因表达量也出现显著下调的变化， OsGLO4基因表达差异不显著。转基因水稻株高变矮、叶长变短。与日本晴相比，OsCATAi转基因水稻定量PCR分析显示OsCATA基因表达下降到28％和15％;Western blot分析显示OsCATA蛋白含量降低到不能被检测出，CAT活性下降到7％和6％。同时OsCATC基因表达显著增加，达到750％和816％，OsCATB基因表达未出现显著性变化。转基因水稻株高变矮，叶片出现白色病斑，花期延迟5-10天。
　　3.OsGLO5i转基因水稻光饱和点和CO2饱和点下降，且400μmol·mol-1 CO2浓度和800μmol·m-2·s-1光照强度下净光合速率略有下降，表达分析显示编码C2途径相关酶基因OsHPR和OsGDC表达下降，Rubisco活性显著下降，编码C3途径相关酶基因OsrbcL、OsRPI和OsFBA表达也显著下降。叶绿素荧光参数、编码光系统蛋白基因表达、抗氧化酶活性和编码抗氧化酶基因表达等与日本晴和转空载体水稻相比差异不显著，抗氧化物质ASC含量、DHA含量、GSH含量和GSSG含量在不同株系中出现显著增加的变化。田间农艺性状数据显示，穗长、粒宽和百粒重均出现显著下降的变化，单株产量在部分株系也出现了显著性下降，粒长和穗数变化不显著。
　　4.OsCATAi转基因水稻光饱和点和CO2饱和点显著下降，且400μmol·mol-1 CO2浓度和800μmol·m-2·s-1光照强度下净光合速率显著下降，表达分析显示编码C2和C3途径相关酶基因OsFBA、OsrbcL、OsRPI、OsHPR和OsGDC表达量下降，Rubisco初始活性和总活性显著下降。叶绿素荧光参数Fv/Fm、qN、qP和Yield均出现下降的变化，编码光系统蛋白基因OsPsb H、OsPsb R和OsLHC表达量也出现显著下降的变化。抗氧化酶SOD活性、APX活性、GPX活性和GR活性等显著增加，且编码抗氧化酶基因OsSOD、OsAPX、OsGPX和OsGR表达也出现增加的变化，抗氧化物质ASC含量、DHA含量、GSH含量和GSSG含量等也显著增加，H2O2含量也表现出显著增加，但是并没有出现成倍增加的变化。
　　5.不同浓度CO2和O2处理下，OsGLO5i转基因水稻和日本晴的数字基因表达谱分析结果表明，与正常空气中相比日本晴在高CO2处理下分别有451个基因表达上调，496个基因表达下调;在低O2处理下有282个基因表达上调，397个基因表达下调;在高O2处理下有445个基因表达上调，564个基因表达下调。与正常空气中日本晴相比OsGLO5i转基因水稻有763个基因表达上调，191个基因表达下调，在不同浓度CO2和O2处理下上调和下调的基因数分别为:1272∶289（高CO2处理）、1337∶885（低O2处理）和1505∶727（高O2处理）。
　　6.与正常空气中相比，日本晴在高CO2处理下，Rubisco初始活性和总活性降低，GLO活性降低，净光合速率和总光合速率均出现下降的变化，编码C2和C3途径相关酶基因OsrbcL、OsRPI、OsGLO5、OsHPR和OsGDC等均出现下调的变化。叶绿素荧光参数qP和Yield也表现出下降的变化。抗氧化酶CAT活性则出现下降的变化，GSH含量和GSSG含量也表现出下降的变化。在低O2处理下，日本晴的生理和分子上的变化和在高CO2处理下相似，Rubisco初始活性和总活性降低，GLO活性降低，净光合速率和总光合速率均出现下降的变化，但是均比高CO2处理下要高。叶绿素荧光参数qP、Yield和抗氧化酶活性的变化也表现出与高CO2处理下相同的变化趋势。在高O2处理下，日本晴的生理和分子上的变化与正常空气中差异较小，Rubisco活性、GLO活性、净光合速率、总光合速率、叶绿素荧光参数qP、Yield、抗氧化酶活性和抗氧化物质含量等与高CO2处理相比，基本表现出增加的变化。
　　7.与日本晴和转空载体水稻相比，OsGLO5i转基因水稻在不同气体处理下，GLO活性和总光合速率均显著降低;在高O2处理下Rubisco初始活性和总活性均显著下降，净光合速率、qN、qP和Yield等也显著下降，且编码相关代谢途径基因表达分析结果也表现出下降的变化;抗氧化酶活性和抗氧化物质含量在不同气体下均未出现显著的一致性变化。在高CO2和低O2处理下，OsGLO5i转基因水稻与日本晴和转空载体水稻相比差异较小。
　　综上所述，OsGLO5i转基因水稻和OsCA TAi转基因水稻田间结果，和不同浓度CO2和O2处理结果表明，光呼吸代谢对卡尔文循环有反馈作用，当光呼吸降低超过一定范围时，卡尔文循环固定的CO2会下降，即使在一定范围内，也没有表现出光呼吸下降而卡尔文循环固定的CO2增加的情况。光呼吸代谢对光系统具有保护作用，这种保护可能和卡尔文循环相关，即光呼吸下降且引起卡尔文循环下降时，光系统会受到伤害;光呼吸对抗氧化系统的影响，可能不是直接通过过氧化物酶体中产生的H2O2起作用的，而是通过影响光系统，由光系统产生的活性氧影响抗氧化系统的。

目录

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1．1 光呼吸代谢研究进展

1．1．1 光呼吸代谢途径

1．1．2 光呼吸的分子生物学研究

1．1．3 光呼吸代谢途径中的能量代谢

1．2 光呼吸和光合作用的偶联

1．2．1 Rubisco酶

1．2．2 碳素代谢和能量代谢

1．2．3 光呼吸和光合作用的调控

1．3 光呼吸和抗氧化系统

1．3．1 光呼吸代谢活性氧的产生和清除

1．3．2 光呼吸代谢对细胞内活性氧系统的影响

1．3．3 H2O2在信号转导中的功能

1．4 本研究的目的和意义

第二章 OsGLO5基因干扰载体的构建、遗传转化及转基因水稻鉴定

2．1 材料和方法

2．1．1 植物材料

2．1．2 试剂

2．1．3 水稻总RNA的提取和反转录

2．1．4 OsGLO5基因干扰载体的构建

2．1．5 农杆菌介导的遗传转化

2．1．6 转基因水稻的鉴定

2．2 结果与分析

2．2．1 OsGLO5i载体酶切鉴定

2．2．2 OsGLO5i转基因水稻GUS组织化学活性检测

2．2．3 OsGLO5i转基因水稻纯合单株筛选

2．2．4 OsGLO5i转基因水稻材料鉴定

2．2．5 OsCATAi转基因水稻材料鉴定

2．3 讨论

第三章 OsGLO5基因在调控光呼吸与光合作用及抗氧化系统中的功能

3．1 材料和方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 农艺性状观察及测定

3．1．3 酶活性测定和抗氧化物质含量分析

3．1．4 淀粉和蔗糖含量测定

3．1．5 光合作用参数和叶绿素荧光参数测定

3．1．6 H2O2和O2-组织化学检测

3．1．7 H2O2细胞化学观察

3．1．8 定量PCR分析

3．2 结果与分析

3．2．1 OsGLO5基因对水稻光合作用、Rubisco酶活性和编码C2与C3途径酶基因表达的影响

3．2．2 OsGLO5基因对水稻叶片叶绿素荧光参数和编码光系统蛋白基因表达的影响

3．2．3 OsGLO5基因对水稻抗氧化酶活性和编码抗氧化酶基因表达的影响

3．2．4 OsGLO5基因对水稻抗氧化物质含量的影响

3．2．5 OsGLO5i转基因水稻H2O2和O2-组织化学检测

3．2．6 OsGLO5i转基因水稻内源H2O2细胞化学观察

3．2．7 OsGLO5基因对水稻淀粉和蔗糖含量的影响

3．2．8 OsGLO5基因对水稻农艺性状的影响

3．3 讨论

第四章 OsCATA基因在调控光呼吸与光合作用及抗氧化系统中的功能

4．1 材料和方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 生理和分子数据测定

4．2 实验结果

4．2．1 OsCATA基因对水稻光合作用、Rubisco酶活性和编码C2与C3途径酶基因表达的影响

4．2．2 OsCATA基因对水稻叶绿素荧光参数和编码光系统相关蛋白基因表达的影响

4．2．3 OsCATA基因对水稻抗氧化酶活性和编码抗氧化酶基因表达的影响

4．2．4 OsCATA别基因对水稻抗氧化物质含量的影响

4．2．5 OsCATAi转基因水稻内源H2O2的细胞化学观察

4．3 讨论

第五章 CO2和O2对OsGLO5基因抑制表达转基因水稻叶片光呼吸、光合作用和抗氧化系统的影响

5．1 材料和方法

5．1．1 实验材料

5．1．2 CO2和O2处理实验

5．1．3 生理和分子数据测定

5．1．4 根重测定

5．1．5 数字基因表达谱测序分析

5．2 结果与分析

5．2．1 CO2和O2处理对基因表达的影响

5．2．2 CO2和O2处理对不同基因型水稻株高和根干重的影响

5．2．3 CO2和O2处理对不同基因型水稻光合作用、Rubisco酶活性和编码C2与C3途径酶基因表达的影响

5．2．4 CO2和O2处理对不同基因型水稻叶绿素荧光参数和编码光系统蛋白基因表达的影响

5．2．5 CO2和O2处理对不同基因型水稻抗氧化酶活性和编码抗氧化酶基因表达的影响

5．2．6 CO2和O2处理对不同基因型水稻抗氧化物质含量的影响

5．2．7 OsGLO5i转基因水稻在CO2和O2处理下H2O2和O2-组织化学检测

5．2．8 OsGLO5i转基因水稻在CO2和O2处理下内源H2O2的细胞化学定位

5．2．9 CO2和O2处理对不同基因型水稻淀粉和蔗糖含量的影响

5．3 讨论

5．3．1 OsGLO5i转基因水稻数字基因表达谱GO分析

5．3．2 CO2和O2处理光呼吸代谢、卡尔文循环、光系统和抗氧化系统的影响

第六章 总结

参考文献

附录

攻读博士期间待发表的论文

致谢

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