利用特定转录因子的mRNA诱导获得山羊iPS细胞的研究

摘要

体细胞中导入特定的多能性转录因子可以将体细胞重编程为诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPS)。截止到目前，已成功的获得人、牛、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、猴、兔、猪等物种的iPS细胞。iPS细胞具有和胚胎干细胞(Embryonic stemcells，ESC)类似的多能性等特性，该技术对于难以建立胚胎干细胞系的动物无疑提供了一种可行的替代方案。但是，最初建立iPS细胞的传统方法是利用病毒载体将特定诱导因子Oct4、Sox2、Klf4和c-myc转入体细胞内，病毒的转染效率不能达到100％，获得4个诱导因子同时表达的细胞比例很低，且病毒载体会随机插入到体细胞的基因组中，可能导致正常基因的表达受到影响，或引起基因突变并激活原癌基因的表达。质粒载体、多蛋白表达系统、化学小分子以及转座系统虽然尽可能地减少了外源基因和病毒元件的整合，使获得iPS细胞的安全性获得提高，但由于操作复杂、分析困难、制备效率低等原因制约着iPS细胞制备技术的发展。相比于以上制备iPS细胞技术，mRNA诱导技术在理论上存在优势:一方面避开了外源基因插入体细胞基因组的风险;另一方面诱导效率较上述方法提高100倍，且细胞重新编程的速度提高了一倍。本研究利用mRNA诱导技术通过将山羊源性Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的mRNA导入山羊体细胞，对诱导体系和培养体系进行优化，成功将山羊体细胞重编程为山羊iPS细胞。此外，利用优化的培养体系将诱导获得的一株山羊iPS细胞成功传至22代。本文主要研究结果如下: 1.山羊iPS细胞相关的四个多能性转录因子的克隆与分析。 参考GenBank中已公布的山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc(简称OSKC)的序列，设计并合成相关特异性引物。采用RT-PCR的方法，从山羊胎儿生殖嵴、表皮和小肠组织获取山羊OSKC的编码序列(CDS)。测序结果表明，OSKC基因的CDS长度分别为1083bp、962bp、1434bp和1320bp。同源性分析表明，山羊OSKC核苷酸序列与山羊、绵羊、牛和猪相应序列具有高度的保守性，同源性分别为:Oct4(100％、100％、97％和94％)，Sox2(100％、100％、98％和94％), Klf4(100％、100％、97％和94％), c-Myc(100％、100％、94％和91％，表明克隆获得的山羊各基因的序列正确。 2.不同pcDNA3.0真核表达载体的构建以及体外转录 将上述获得的OSKC基因和pcDNA3.0载体分别用相应限制性内切酶进行双酶切，连接转化后，经菌液PCR、单双酶切鉴定、测序，成功获得重组pcDNA3-oct4、pcDNA3-sox2、pcDNA3-klf4和pcDNA3-c-myc真核表达载体。 按照体外转录试验的要求，成功获得“加尾”和“加帽”的各特异性转录因子的mRNA。OSKC转录因子和EGFP的mRNA的浓度值分别为283.55ng/ul、274.81ng/ul、448.54ng/ul、295.73ng/ul、315.43ng/ul，OD值分别为1.89、1.89、1.96、1.92、1.99;在260nm波长处10mm吸光度值有唯一极值。表明获得的OSKC基因和EGFP的mRNA较纯净，能满足后续转染试验的要求。 3.山羊iPS细胞诱导和培养体系的优化 本试验研究不同饲养层种类和培养液对山羊iPS细胞获得和培养的影响。结果显示，山羊iPS细胞在接种密度为“MEF细胞∶GEF细胞=1∶1”的饲养层上，用“KnockoutDMEM+20％ KSR”组合的培养液，山羊iPS细胞的诱导效率以及消化传代后F2、F3代的克隆形成率最高，分别为1.15％、63.21％、36.98％。用形态学标准选择形态好的原代克隆进行扩大培养，一株山羊iPS细胞利用该培养体系已传至22代。 4.山羊iPS细胞的生物学特性 本试验诱导获得的山羊iPS细胞克隆呈集落性生长，克隆隆起呈岛状，细胞亮度高，边缘整齐、光滑、折光性强，细胞排列紧密，与饲养层细胞边界清晰，与山羊ES细胞克隆、小鼠iPS细胞克隆类似且AP染色呈阳性;RT-PCR试验结果表明山羊iPS细胞系表达多种ES细胞标记基因，包括Oct4、Sox2、Nanog、 Dax1、Dnmt3b和Gdf3;免疫荧光检测结果表明山羊iPS细胞系表达ES细胞的标记物Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、 Rex1、SSEA-1、TRA-1-60和TRA-1-81;山羊iPS细胞具有正常的核型，为58条常染色体和2条性染色体;山羊iPS细胞体外延时培养可自发分化成类上皮细胞、类神经细胞和类脂肪细胞，体外悬浮培养可形成类胚体。 5.mRNA诱导下的山羊体细胞重编程机制 细胞形态学试验结果表明转染mRNA后的山羊体细胞在形态上发生变化;qRT-PCR结果显示GEF细胞在转染mRNA第12天后，内源性Nanog、 Tert基因开始表达，结果表明内源调控网络机制被激活，并开始内源性基因的表达;Western blot试验结果与qRT-PCR结果类似，均表明内源调控网络机制在mRNA转染12天后被激活。综上所述，转染后初期体细胞的重编程主要依靠OSKC转录因子的外源表达来推动，12天后山羊iPS细胞多能性主要依靠相关转录因子的内源表达来维持。

目录

论文说明

摘要

符号表(缩略语表)

前言

第一章 iPS细胞的研究进展

1 前言

2 iPS细胞诱导技术概述

2．1 采用基因插入不可删除型运载系统诱导

2．2 采用基因插入可删除型运载系统诱导

2．3 采用无基因插入型运载系统诱导

2．4 采用无核酸参与型运载系统诱导

3 iPS细胞诱导培养体系概述

3．1 目的细胞的选择

3．2 诱导培养条件

3．3 iPS细胞的表观遗传学检测

4 iPS细胞的应用前景

4．1 构建动物模型

4．2 建立疾病模型

4．3 新药发现及筛选

4．4 转基因动物研究

第二章 山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因克隆

1 材料和方法

1．1 材料与试剂

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的克隆

2．2 Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因序列测定及同源性分析

3 讨论

第三章 真核表达载体构建及转录因子体外转录

1 材料和方法

1．1 材料与试剂

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 真核表达载体构建

2．2 转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的体外转录

3．讨论

第四章 山羊iPS细胞诱导及培养体系的优化

1 材料和方法

1．1 材料与试剂

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 GEF细胞和MEF细胞形态

2．2 mRNA诱导山羊体细胞重编程成iPS细胞

2．3 不同培养体系对山羊体细胞重编程的影响

2．4 不同培养体系对山羊iPS细胞生长的影响

2．5 最佳培养体系山羊iPS细胞干性检测

3．讨论

第五章 山羊iPS细胞生物学特性及重编程机制研究

1 材料和方法

1．1 材料与试剂

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 利用mRNA体系诱导获得山羊iPS细胞

2．2 山羊iPS细胞具有典型的ES细胞形态和特异性标记物的表达

2．3 诱导过程中的重编程机制

2．4 山羊iPS细胞的表观遗传状态

2．5 山羊iPS细胞具有在体外形成三种胚层细胞的能力

3．讨论

全文结论

参考文献

附录

致谢

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