猪源2009甲型H1N1大流行流感病毒及其H9N2重组病毒在哺乳动物模型的致病性和传播特性

摘要

2009甲型H1N1大流行流感病毒的爆发造成了本世纪的第一次流感大流行，短短数个月该病毒通过人与人的高效传播迅速遍及全世界。遗传进化表明，2009甲型H1N1由长期存在于猪群的北美三源重排猪流感和欧亚类禽猪流感重组产生。这是第一次有直接证据表明猪这种流感病毒的“中间宿主”对流感大流行产生的重要作用。当前，越来越多的报道表明2009甲型H1N1大流行流感病毒从人传播至猪，并且和地方流行性猪流感病毒发生着重组，甚至存在着和禽流感病毒重组产生新的具有流感大流行潜力病毒的风险。因此，开展猪流感病毒的监测并对2009甲型H1N1流感病毒及其重组病毒的致病性、传播特性及其机制研究，对再次的流感大流行的预测和防控具有重要意义。 本实验室于2010年对江苏地区的猪流感流行病学监测中，分离了4株2009甲型H1N1大流行流感病毒。全基因组测序表明它们和人源2009甲型H1N1参考株A/California/04/2009(CA04)十分接近。为研究这5株病毒对哺乳动物的致病性，我们首先在BALB/c和C57BL/6两种小鼠动物模型上对它们的MLD50进行了测定。结果显示，4株猪源的2009甲型H1N1病毒均比CA04的致病性强，其中以A/Swine/Jiangsu/38/2010(JS38)在BALB/c小鼠模型上差异最为显著。同时，JS38比CA04引起更严重的小鼠体重下降和死亡率。因此，我们选择JS38和CA04作为一对模式病毒进一步研究其致病机制。结果显示，JS38在哺乳动物细胞和小鼠肺脏的复制能力均要显著强于CA04，并且可以引起小鼠肺脏更严重的病理变化。通过对攻毒后小鼠肺脏的湿干重比和肺指数的测定显示，JS38比CA04引起更严重的肺水肿。JS38还能对小鼠肺脏引起更强烈的免疫应答，攻毒后第3天和第5天小鼠肺脏的巨噬细胞数目显著下降，但淋巴细胞和中性粒细胞较CA04显著上升;对攻毒后的肺内细胞因子表达水平检测发现，攻毒JS38和CA04的小鼠均可以引起多种细胞因子的高水平表达，但只有IL-6、IL-10和IFN-β差异显著。以上结果与人临床感染2009甲型H1N1的中等致病病例和严重病例的情况十分接近，表明我们以JS38和CA04这对模式病毒成功建立了评价强弱毒力的2009甲型H1N1病毒的小鼠动物模型。 流感病毒获得结合α2，6唾液酸受体的能力是其在哺乳动物间有效传播的先决条件。为进一步研究5株2009甲型H1N1病毒在哺乳动物模型的传播能力，我们首先对其进行了受体结合能力的测定。结果表明，人源2009甲型H1N1参考株CA04显示出完全的α2，6唾液酸受体（人源受体）结合能力，而其余4株猪源的2009甲型H1N1病毒均获得了不同程度的结合α2，3唾液酸受体（禽源受体）的能力。其中， A/Swine/Jiangsu/46/2010(JS46)和A/Swine/Jiangsu/48/2010(JS48)两株流感病毒显著偏嗜于结合α2，3唾液酸受体。与在豚鼠动物模型上的直接接触传播能力测定结果相对应，JS46和JS48分别表现出一过性的和无法检测到的直接接触传播能力，而其余的病毒的直接接触传播效率为100％。因此，我们假设是JS46和JS48的受体结合能力的改变导致这种直接接触传播能力的下降。通过生物信息学的方法比较了JS48和CA04的HA蛋白序列和结构的差异，初步确定HA的N159D和Q226R双突变的联合作用改变了病毒的受体结合能力。为证明N159D和Q226R联合突变对直接接触传播能力的影响，通过反向遗传技术拯救了CA04原毒rCA04，单突变病毒rCA04-159和rCA04-226，以及双突变病毒rCA04-159/226，并在此在豚鼠模型进行了直接接触传播能力的检测。结果显示，只有双突变病毒rCA04-159/226的直接接触组豚鼠鼻洗液无法检测到病毒，其余3株拯救毒均可以发生100％的传播效率。进一步的统计表明，双突变后的rCA04-159/226在攻毒组豚鼠鼻腔的复制能力显著降低。单突变Q226R可以通过减慢病毒传播速率的方式影响直接接触传播。然而，尽管rCA04-159/226双突变病毒接触组豚鼠无法检测到排毒，血清抗体检测却显示出60％的豚鼠发生了血清阳性转换，表明N159D和Q226R双突变具有联合作用可以极显著的降低直接接触传播能力，但并没有使传播完全消失。 我们在对江苏地区的猪流感流行病学监测中还发现，当前流行于我国的h9.4.2.5的H9N2禽流感病毒也感染猪群，这就为H9N2禽流感病毒与2009甲型H1N1大流行流感病毒的重组提供了可能。为了预测这种重组的潜在大流行风险，我们通过反向遗传技术，以CA04、JS48和A/Swine/Jiangsu/285/2010(JS285)三株不同宿主源的2009甲型H1N1的内部基因为骨架，将一株猪源的H9N2禽流感病毒A/Swine/Taizhou/5/08(TZ5)的HA单替换或将HA和NA双替换其中分别拯救了H9N1-pH1N1和H9N2-pH1N1重组病毒。重组的H9病毒在体外哺乳动物细胞上表现出比H9N2和2009甲型H1N1亲本毒株更强的复制能力，在豚鼠的鼻腔和小鼠的肺脏中的体内复制能力也显著强于亲本的H9N2毒株。豚鼠传播实验结果表明，亲本的H9N2毒株TZ5无法在豚鼠模型获得直接接触和气溶胶传播，而重组的H9病毒无须在豚鼠体内适应就可以获得高效的直接接触和气溶胶传播能力，且H9N2-pH1N1重组病毒的气溶胶传播能力要高于H9N1-pH1N1重组病毒。同时，我们以小鼠作为动物模型检测了重组病毒的致病性，结果显示重组病毒在MLD50、平均体重下降和平均死亡时间均表现出比亲本的H9N2毒株更强的致病性，然而，有趣的是与传播能力相反，H9N1-pH1N1重组病毒要比相应的H9N2-pH1N1重组病毒毒力要强。 本研究对不同宿主的2009甲型H1N1流感病毒的致病性和传播特性进行了比较，并在哺乳动物模型上对2009甲型H1N1的致病和传直接接触传播能力的机制进行了阐明，同时预测了H9N2禽流感病毒和2009甲型H1N1重组的潜在风险，对我国猪流感病毒的科学防控和流感大流行的预测预警具有重要的意义。

目录

摘要

符号说明

综述 流感病毒的传播及动物模型

1 流感病毒的传播方式

2 影响流感病毒传播的因素

3 流感大流行及潜在的大流行风险

4 流感病毒研究的哺乳动物模型

参考文献

第一章 猪源2009甲型H1N1大流行流感病毒对小鼠的致病性及引起的肺内损伤和免疫应答

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二章 猪源2009甲型H1N1大流行流感病毒的直接接触传播能力及影响传播的关键氨基酸

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三章 H9N2亚型禽流感与2009甲型H1N1大流行流感的重组病毒传播特性和致病性研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文小结和创新点

致谢

攻读博士学位期间发表的学术论文

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