J亚群禽白血病病毒JS09GY3株感染特性及感染鸡法氏囊转录组学分析

摘要

禽白血病(Avian leukosis)是由反转录病毒科中禽白血病/肉瘤病毒(Avian leukosissarcoma virus，ALSV)引起的禽类良性和恶性肿瘤性传染性疾病。禽白血病在临床上有多种类型，如淋巴细胞性白血病、成红细胞性白血病、髓细胞性白血病、血管瘤、肾瘤、肉瘤和骨石化症等，同时导致鸡只体重增长下降、鸡群产蛋性能降低、免疫抑制。鸡的ALV分为6个亚群，即A、B、C、D、E、J，其中E亚群为内源性ALV，其余亚群为外源性ALV。J亚群ALV(ALV-J)于1988年首次在英国被鉴定，然后迅速传播到世界其它国家，给世界养禽业造成了严重的经济损失。在中国大陆，1999年首次从肉鸡中分离到ALV-J。目前，ALV-J感染在中国鸡群中流行很普遍，肿瘤类型多样，并向中国地方品系鸡群扩散。研究中国ALV-J分离株的感染特性有助于理解ALV-J的致病机制。 本研究以ALV-JJS09GY3毒株为研究对象，观察了其感染SPF白来航鸡后抗原抗体的变化、临床症状和组织病理学变化以及肿瘤类型的变化等感染特性，并应用基因芯片分析了感染鸡法氏囊中的差异表达基因，为理解ALV-J的致病机制提供了新的观点。 1.不同日龄鸡感染ALV-J的抗原和抗体变化规律 为了解鸡感染ALV-J后抗原和血清中抗体的变化规律，本研究经卵黄囊途径或肌肉途径，将ALV-J JS09GY3株分别感染6胚龄SPF鸡胚、31日龄和56日龄SPF鸡，于感染后不同时间采集胎粪或泄殖腔棉拭子，同时采集血液、分离血清，以检测p27抗原、ALV-J特异性抗体（J型抗体）和p27抗体。结果显示，胚胎组在各检测点均可检测到p27抗原（仅1只鸡在1日龄时为阴性），而31日龄组和56日龄组检测不到p27抗原;胚胎组没有检测到 p27抗体，31日龄组中80％(4/5)的鸡在3次重复感染后可检测到p27抗体，56日龄组在首次感染后p27抗体的检出率较高(60％);各组的J型抗体在各检测点上基本为阴性。结果表明，胚胎期感染ALV-J的鸡在出壳后形成免疫耐受，可通过泄殖腔排毒，但其不产生抗体;而高日龄鸡感染ALV-J后不通过泄殖腔排毒，大多数鸡产生p27抗体，但基本不产生J型抗体。 2.不同方法检测J亚群禽白血病的效果比较与分析 禽白血病是危害家禽养殖业的一种重要的病毒性肿瘤性传染病。快速准确诊断病毒感染对禽白血病的净化具有重要意义。本研究通过病毒分离方法、PCR方法和组织病理学方法对经卵黄囊途径感染ALV-J JS09GY3株后孵出的鸡在不同时间点进行了J亚群禽白血病的检测分析。结果显示，20份样品中，病毒分离-ELISA阳性率为65％，而病毒分离-IFA阳性率为75％，PCR的阳性率为95％，有2只鸡在肝脏上有大体病变，在肝脏、肾脏、心脏和肺脏上出现组织细胞学的变化，而脾脏上没有观察到组织细胞学的变化。研究表明，不同方法检测J亚群禽白血病的结果存在差异，PCR检测的阳性率最高，其在J亚群禽白血病的早期感染检测具有重要意义。 3.ALV-J JS09GY3株对SPF鸡的感染特性研究 为了解ALV-J JS09GY3株对SPF鸡的感染特性，本研究将ALV-JJS09GY3株通过卵黄囊途径感染6胚龄鸡胚，孵化后将鸡饲养至20周龄，观察临床症状和病理变化，并采集泄殖腔棉拭子以检测p27抗原，采集血液分离血清以检测p27抗体和J型抗体，采集抗凝血分离病毒。结果显示，ALV-J JS09GY3株可以引起感染鸡的死亡;对鸡的体重增长有一定的抑制作用，在8和12周龄时呈显著抑制(p＜0.05);肿瘤总体发生率为72.22％，在4周龄时可以观察到肿瘤样变化，随着日龄增加，机体许多组织器官出现肿瘤;其中血管瘤发生率达58.33％;经组织切片观察，除了经典的血管瘤现象外，还发现了卵巢腺癌和肌肉纤维瘤等;在20周试验期内，可以检测到泄殖腔中的p27抗原，从血液中分离到ALV-J，但不能检测到J型抗体，而p27抗体仅在16和20周龄的部分鸡只中检出。结果提示，JS09GY3株ALV-J的感染性较强，可以用作为建立ALV-J感染生物模型用的生物材料。 4.ALV-J感染SPF鸡法氏囊转录组学分析 ALV-J感染鸡只后，可导致肿瘤、免疫抑制和提高对其它病原的易感性，进而导致鸡群的高发病率和高死亡率。然而，鸡感染ALV后的机能反应状况还不清楚。本研究通过基因芯片技术探讨了ALV-J JS09GY3株感染SPF鸡后，其法氏囊产生的一系列反应。结果显示，感染鸡法氏囊组织中出现594个差异表达的转录子(差异倍数≥2，p＜0.05)，这些差异表达基因涉及细胞过程、结合、生物学调节、代谢加工、刺激反应和免疫系统等反应。通过信号通路分析发现，差异表达基因主要参与了细胞因子-细胞因子受体相互作用、JAK-STAT信号通路、RIG-I-like受体信号通路等。这些差异表达基因主要集中在chr1、chrUn_random、chr2、chr4、chr7等染色体中。对这些差异表达基因编码蛋白的相互作用进行String预测分析表明，许多差异表达基因编码的蛋白之间存在着相互作用。本研究获得的ALV-J JS09GY3株感染鸡法氏囊反应谱为更好的理解ALV-J感染的分子机制提供了理论基础。

目录

摘要

符号说明

第1章 禽白血病研究进展

1 禽白血病研究简史

2 禽白血病的公共卫生意义

3 禽白血病病毒

4 禽白血病的流行病学

5 禽白血病的临床表现

6 禽白血病的致病机制

7 禽白血病的诊断

8 禽白血病的防制

第2章 转录组学技术在动物病原研究中的应用

1 转录组学技术在动物性细菌研究中的应用

2 转录组学技术在动物性病毒研究中的应用

3 转录组学技术在动物性寄生虫研究中的应用

第3章 不同日龄鸡感染ALV-J的抗原和抗体变化规律

1 材料与方法

2 结果与分析

3 小结与讨论

第4章 不同方法检测J亚群禽白血病的效果比较与分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 小结与讨论

第5章 ALV-J JS09GY3株对SPF鸡的感染特性研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 小结与讨论

第6章 ALV-J感染SPF鸡法氏囊转录组学分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 小结与讨论

参考文献

全文小结

致谢

博士期间发表的文章及出版的著作

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