扬州鹅繁殖的光照调控及下丘脑基因差异表达研究

摘要

作为季节性繁殖家禽，鹅的繁殖性能受季节影响较大。扬州鹅是我国培育的第一个鹅品种，其繁殖具有典型的部分长日照型特点，因此对扬州鹅的繁殖进行光照调控具有重大生产意义。 本文通过光照调节来研究光照对扬州鹅繁殖性能和繁殖生理等方面的影响，并采用抑制性消减杂交技术，筛选影响种鹅季节性繁殖的相关基因，为种鹅稳产、高产的环境控制和高产品种鹅的选育提供参考依据。 一、自然光照条件下种鹅产蛋规律及血清生化指标、生殖激素水平的变化规律 试验鹅全程采用自然光照，公母鹅混群饲养，每月统计鹅群的产蛋率，并于每月11-15日上午9:00-10:30随机取15只母鹅、10只公鹅，进行翅静脉采血，离心收集血清，用于相关血液指标的测定。同时随机取6只种母鹅和3只种公鹅屠宰，取下丘脑和垂体，用于测定相关基因的表达量;分离心脏、肝脏等内脏器官、称重，分离生殖系统的组织、器官，进行重量或长度测定;取输卵管放入福尔马林溶液，用于组织切片制作。结果表明: 1、种鹅2月份的产蛋率最高，随后逐渐下降，7～10月份停产，11月份又重新产蛋，且产蛋率逐渐上升。 2、光照延长或缩短所引起的公母鹅血清总蛋白和白蛋白含量的变化规律是一致的。光照延长时母鹅在各时间点的血清总蛋白含量均高于光照缩短时。类似地，光照延长时种鹅前3个月的白蛋白含量也明显高于光照缩短时。此外，公母鹅血清尿素氮浓度变化随光照时间的延长而增加，反之亦然。 3、在光照延长或缩短3个月后，公鹅的血清促卵泡素(FSH)浓度均处于较高水平，而母鹅则均处于相对较低水平，且血清的FSH水平变化不大。对于血清促黄体素(LH)水平，种鹅在光照长度变化后的第2个月出现较大变化，其中公鹅明显升高，母鹅明显下降。光照延长或缩短在公母鹅均引起血清催乳素水平的变化，但变化趋势相反;然而，光照延长或缩短引起的母鹅血清雌二醇(E2)浓度变化规律却相似。 4、公母鹅的心脏指数均随光照时间的延长而发生变化，但变化趋势相反。母鹅的卵巢指数随光照时间的延长而不断下降，但整个延长期均大于光照缩短时的卵巢指数。光照延长或缩短引起的公鹅睾丸指数变化趋势相反;在光照延长的前4个月，公鹅睾丸指数大于光照缩短时的公鹅睾丸指数，而4个月后则小于光照缩短时的公鹅睾丸指数。光照长度变化引起的母鹅输卵管指数和输卵管长度变化趋势一致，且光照延长时输卵管指数和输卵管长度均明显大于光照缩短时;光照延长时母鹅的卵泡数逐渐减少，而光照缩短时母鹅的卵泡数逐渐增多，两者变化趋势相反。 5、在光照延长或缩短的前4个月，种鹅垂体中FSH的相对表达量均呈现升高的趋势，只是光照延长时种鹅FSH表达量升高的幅度更大。然而，在第5、6个月，两者变化趋势相反。 6、在光照延长的前3个月，种鹅输卵管膨大部腺体具有明显的管腔，在第4个月腺体管腔则明显缩小，第5、6个月时细胞质中均出现空泡，腺体管腔变模糊。当光照缩短时，输卵管膨大部组织结构变化趋势与光照延长时相反。此外，光照延长和缩短引起的种鹅输卵管峡部、子宫部组织结构变化规律与膨大部相似。 二、不同光照和温度处理对母鹅血清生化指标、生殖激素水平、繁殖机能的影响 采用二因子方差分析，将120只成年母鹅随机分成6组，每组20只，分别是组1(0-5℃、8hL)、组2(0-5℃、12hL)、组3(0-5℃、16hL)、组4(25-30℃、8hL)、组5(25-30℃、12hL)、组6(25-30℃、16hL)。所有试验鹅饲养于密闭鹅舍。试验期每隔10天，于上午9:00-10:30随机取5只鹅进行翅静脉采血，静置、离心后收集血清，用于相关血液指标的测定。同时每个处理随机取3只鹅，屠宰，取下丘脑和垂体，用于相关基因表达量的测定;分离心脏、肝脏等内脏器官并称重，分离生殖组织或器官，进行重量或长度测定，同时取输卵管放入福尔马林溶液，用于组织切片制作。结果表明: 1、不同光照、温度处理的种鹅前20天的血清总蛋白、白蛋白、碱性磷酸酶、尿素氮含量变化稍小，但30天后变化幅度明显加大。 2、不同光照、温度处理第20天时，各组间生殖激素呈现出较大差异，其中组1和组2鹅血清LH浓度明显升高;第30天后，各组鹅血清FSH浓度呈现出较大差异，其中组3鹅血清FSH浓度相对较低，组4鹅血清FSH浓度相对较高;不同光照、温度处理前20天鹅血清PRL浓度均较高，且各组间差异较大，而后逐渐减低并趋于一致;不同光照、温度处理下各组间鹅血清E2的浓度差异随着时间的延长逐渐增大，第50天时达到最大，其中组2和组6鹅血清E2的浓度变化相对小一些。 3、不同光照、温度处理影响鹅心脏指数和肝脏指数，其中组3变化相对大一些，组5变化相对小一些;组4、组5鹅肝脏指数随时间的变化较小，但组5鹅肝脏指数基本都大于组4。不同光照、温度处理对鹅繁殖系统产生了较大影响，其中组4和组5鹅卵巢指数、卵泡指数均较大，组1和组3较小;组4、组5鹅的卵泡数较多，组3鹅的卵泡数较少;组4、组5鹅的输卵管指数、输卵管长度较大，组1和组3的较小。 4、不同光照和温度处理对处理30天的鹅血清生化指标影响较大，组5的鹅血清总蛋白含量显著高于组1、组2、组3（P＜0.05），组4鹅血清碱性磷酸酶含量显著高于组1、组3(P＜0.05)，组5鹅血清尿素氮浓度显著高于组2(P＜0.05)，极显著地高于组1、组3、组6(P＜0.01)。12h光照处理组鹅血清尿素氮浓度显著高于16h组(P＜0.05)。 5、不同光照和温度处理对处理30天的鹅血清激素指标产生了一定影响，其中组6鹅血清LH含量显著高于组2、组4(P＜0.05)，组6鹅血清PRL含量显著高于组1、组2、组3、组5(P＜0.05)。高温处理组鹅血清LH、PRL含量均极显著高于低温组(P＜0.01)。 6、不同光照和温度处理对处理30天的鹅内脏器官影响较小，只是组3鹅心脏指数显著大于组2、组4(P＜0.05)，其他各组间肝脏指数、脾脏指数差异均不显著(P＞0.05)。 7、不同光照和温度处理对处理30天的鹅繁殖系统产生较大影响，其中组2、组4、组5鹅卵巢指数较大，均显著大于组6(P＜0.05)，组4鹅卵泡指数显著大于组3、组6(P＜0.05)，组4鹅卵泡数显著大于组3、组6，组2、组4鹅输卵管指数显著大于组3(P＜0.05)，组2、组5鹅输卵管长显著大于组1(P＜0.05);12h光照处理组鹅卵巢指数、卵泡指数均极显著大于16h组(P＜0.01)，8h光照处理组鹅卵泡数显著影响大于16h组(P＜0.05)，12h光照处理组鹅输卵管的长度显著大于8h组和16h组(P＜0.05);高温处理组鹅输卵管指数极显著大于低温组(P＜0.01)。 8、光照和温度处理30天，8h光照处理组鹅垂体FSH基因表达量显著高于12h组和16 h组（P＜0.05），16 h光照处理组鹅垂体PRL基因表达量显著高于8h组和12 h组(P＜0.01)。 三、恒定光照对种鹅血清生化指标、生殖激素水平、繁殖机能的影响 于2月份，取自然繁殖期的扬州鹅种鹅7只，其中6只母鹅、1只公鹅，饲养于密闭鹅舍，施以11 h/d的恒定光照处理，定期采集血样，用于测定血清生化指标和激素指标，饲养至6个月，随机取5只母鹅屠宰，同时随机取5只自然光照下的种母鹅、屠宰，取下丘脑和垂体，用于相关基因表达量测定及免疫组化检测;分离心脏、肝脏等内脏器官并称重，分离生殖系统，进行重量或长度测定;取输卵管放入福尔马林溶液，用于组织切片制作，结果表明: 1、恒定光照下母鹅血清总蛋白、白蛋白、胆固醇含量变化趋势趋于一致，均是先升高再下降，又逐渐升高;雌二醇浓度在第2个月大幅升高且达到最高点，然后大幅下降并维持在相对较低水平。 2、恒定光照处理6个月鹅的血清白蛋白、谷草转氨酶含量均显著高于自然光照组（P＜0.05）;两处理组鹅生殖激素指标虽有差异，但未达到显著水平(P＞0.05)。 3、恒定光照处理6个月鹅的肝脏重显著大于自然光照组(P＜0.05)，卵巢重、卵泡重、卵泡数、输卵管重、输卵管长均显著大于自然光照组（P＜0.05）。 4、经免疫组化染色的下丘脑切片，恒定光照处理组、自然光照组均检测到棕黄色或黄褐色形态不一的促性腺激素释放激素(GnRH)、褪黑素(Mel)免疫反应阳性细胞，只是恒定光照处理组GnRH平均灰度值高于自然光照组。 5、恒定光照处理6个月的鹅输卵管膨大部的腺体内具有明显的管腔，血管网密集，峡部初级褶明显，子宫部具有明显的子宫褶，而自然光照组鹅输卵管膨大部的细胞胞质中有空泡出现，腺体管腔模糊，峡部结缔化严重，子宫部血管较少，腺体少，黑色素较多。 四、自然休产期产蛋鹅与休产鹅下丘脑基因差异表达分析 于6月下旬选自然光照下相同家系的半同胞母鹅3对（产蛋鹅3只、休产鹅3只），取下丘脑放于液氮中冷冻保存，用于基因差异表达分析。结果表明: 1、从休产鹅文库和产蛋鹅文库各随机取205个阳性克隆、测序。利用NCBI数据进行BLASTx比对，结果有101条ESTs找到与之匹配的同源序列，以筛选到的E值小于1E-5的片段视为功能已知基因，从休产鹅文库中获得21条功能基因，产蛋鹅文库中获得24条功能基因。 2、对筛选出的差异表达基因进行在线功能聚类分析，通过细胞定位、分子功能、生物学功能发现，休产鹅特异性文库中的基因SMARCA4-201参与雄激素受体结合的过程，产蛋鹅特异性文库中的淋巴增强结合因子参与雌激素受体活性、雌激素受体结合的过程。

目录

摘要

第一章 文献综述

1 鹅的生产现状及其繁殖特点

1．1 我国鹅的生产现状

1．2 鹅的繁殖特点

2 影响鹅繁殖性能的生殖生理因子

2．1 促性腺激素释放激素

2．2 催乳素

2．3 促卵泡素

2．4 促黄体素

2．5 雌激素

2．6 多巴胺

2．7 血管活性肠肽

2．8 各类激素类似物及其作用

3 影响鹅繁殖性能的候选基因

3．1 促性腺激素释放激素基因

3．2 催乳素基因

3．3 促卵泡素基因

3．4 促黄体素基因

3．5 褪黑素基因

4 光照对禽类繁殖性能的影响

4．1 光照对禽类生殖的作用机理

4．2 光照时间对禽类繁殖机能的影响

4．3 光照特性对禽类繁殖机能的影响

4．4 光照在家禽生产上其他方面的应用

4．5 光照在鹅的反季节生产中应用

5 本研究的内容、目的和意义

参考文献

第二章 自然光照条件下种鹅产蛋规律及血清生化指标、生殖激素水平的变化规律

1 材料与方法

1．1 试验动物

1．2 试验设计

1．3 血液指标的测定和方法

1．4 组织总RNA提取和反转录

1．5 引物设计

1．6 PCR扩增

1．7 实时荧光定量PCR

1．8 组织切片制作

1．9 光照变化特点的定义

1．10 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2．1 自然光照下种鹅产蛋率的变化

2．2 不同光照变化特点下种鹅血清生化指标的变化情况

2．3 不同光照变化特点下种鹅血清激素指标的变化情况

2．4 不同光照变化特点下种鹅器官指数的变化情况

2．5 不同光照变化特点下种鹅生殖系统的变化情况

2．6 不同光照变化特点下种鹅输卵管组织的变化情况

2．7 不同光照变化特点下种鹅睾丸组织的变化情况

2．8 种鹅GnRH基因、FSH基因表达量检测

2．9 不同光照变化特点现种鹅GnRH、FSH基因表达情况

3 讨论

3．1 试验时间的界定

3．2 种鹅的产蛋规律

3．3 不同光照特点下种鹅血清生化水平和激素水平的变化

3．4 不同光照特点下种鹅内脏器官的变化

3．5 不同光照特点下种鹅生殖系统的变化

3．6 不同光照变化特点对GnRH、FSH基因表达的影响

3．7 不同光照特点对种鹅输卵管形态学的影响

3．8 不同光照特点对种鹅睾丸形态学的影响

参考文献

第三章 不同光照和温度处理对种鹅血清生化指标、生殖激素水平、繁殖机能的影响

1 材料与方法

1．1 试验动物

1．2 试验设计

1．3 测定指标和方法

1．4 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2．1 不同光照和温度处理对种鹅血清生化指标和激素指标的影响

2．2 不同光照和温度处理对种鹅内脏器官的影响

2．3 不同光照和温度处理对处理30天种鹅血清生化指标和激素指标的影响

2．4 不同光照和温度处理对处理30天种鹅内脏器官的影响

2．5 不同光照和温度处理对处理30天种鹅繁殖系统的影响

2．6 不同光照和温度处理对处理30天种鹅相关基因表达的影响

3 讨论

3．1 不同光照和温度处理对种鹅血清生化指标和激素指标的影响

3．2 不同光照和温度处理对种鹅内脏器官和繁殖系统的影响

3．3 不同光照和温度处理对处理30天种鹅生化指标和激素指标的影响

3．4 不同光照和温度处理对处理30天种鹅内脏器官和繁殖系统的影响

3．5 不同光照和温度处理对处理30天种鹅膨大部组织结构的影响

3．6 不同光照和温度处理对处理30天种鹅相关基因表达的影响

参考文献

第四章 恒定光照对种鹅血清生化指标、生殖激素水平、繁殖机能的影响

1 材料与方法

1．1 试验动物

1．2 试验设计

1．3 测定指标和方法

1．4 免疫组化检测

1．5 GnRH、Mel基因定量测定

1．6 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2．1 恒定光照处理对种鹅血清生化指标和激素指标的影响

2．2 恒定光照处理6个月对种鹅血清生化指标和激素指标的影响

2．3 恒定光照处理6个月对种鹅内脏器官和繁殖系统的影响

2．4 恒定光照处理6个月对种鹅下丘脑GnRH、Mel基因表达的影响

2．5 垂体GnRH、Mel免疫组化检测结果

3 讨论

3．1 恒定光照处理对种鹅血清生化指标和激素指标的影响

3．2 恒定光照处理6个月对种鹅血清生化指标和激素指标的影响

3．3 恒定光照处理6个月对种鹅内脏器官和繁殖系统的影响

3．4 恒定光照处理6个月对种鹅相关基因表达的影响

3．5 恒定光照处理对垂体GnRH、Mel免疫组化检测结果

参考文献

第五章 自然休产期产蛋鹅与休产鹅下丘脑基因差异表达分析

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法及步骤

2 结果与分析

2．1 抑制性消减杂结果分析

2．2 差异表达cDNA文库的PCR检测

2．3 阳性克隆测序及ESTs序列分析

3 讨论

参考文献

第五章 结论

致谢

发表论文、出版著作申请专利情况

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