K88ac+产肠毒素大肠杆菌sepA基因缺失株的构建及其相关功能探析

摘要

产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是引发幼畜，尤其是断奶仔猪腹泻的主要病原菌，被ETEC感染后的仔猪常因剧烈水样腹泻迅速脱水死亡，具有很高的发病率和死亡率，给养猪业带来了严重的经济损失。而菌毛（黏附素）K88是ETEC引发腹泻最重要的毒力因子之一。K88+ETEC侵入宿主肠道后，通过黏附素K88与宿主细胞表面受体特异性结合，从而介导细菌定居、繁殖、肠毒素分泌及适当途径的肠毒素传递，导致腹泻。
　　实验根据GeneBank上已公布的一株E.coli上的sepA基因序列，设计一对引物以扩增检测K88ac+产肠毒素大肠杆菌国内标准株C83902(Wild-type，O8∶H87∶H19)中的sepA基因，根据实验菌株的sepA序列设计缺失引物，该缺失引物5'端与sepA两翼序列同源，3'端与质粒pKD3上cat基因两翼序列同源。以质粒pKD3为模板，应用缺失引物扩增出中间为cat抗性基因片段、两端与sepA基因上下游同源的DNA片段。将其融合片段导入含有质粒pKD46的C83902菌株内，在三种重组酶的作用下，实现氯霉素抗性基因片段与sepA发生同源重组，在氯霉素抗性平板上挑取单菌落并进行PCR鉴定，筛选出一次同源重组菌C83902△sepA∷cat。将质粒pCP20导入一次同源重组菌内，通过利用其编码的Flp重组酶，进行氯霉素抗性基因的消除，经PCR鉴定与测序验证，成功构建出C83902缺失株:C83902△sepA。
　　IPEC-J2细胞的体外黏附实验结果表明，sepA基因缺失株比野生株的黏附能力下降55.3％;通过Real-Time PCR实验检测分析sepA基因缺失株主要毒力因子转录量的变化，结果发现鞭毛(fliC)、菌毛(faeG)、热不稳定肠毒素（eltB）、溶血素（hlyA）、Ⅰ型菌毛(fimA)基因的表达量与野生株无明显差异;通过兔回肠结扎实验，观察到缺失株较野生株肠段积液量更多，且缺失株导致回肠的病理变化更为严重。
　　综合上述实验结果，SepA在介导C83902对宿主细胞黏附的过程中起到了一定作用，而SepA可能会抑制C83902肠毒素的分泌量，达到与宿主长期共存的目的。

目录

摘要

符号说明

文献综述 肠杆菌科丝氨酸蛋白酶(SPATEs)的研究进展

1．1 前言

1．2 Ⅴ型分泌系统

1．3 SPATEs结构

1．4 SPATEs分类

1．5 SPATE致病机制

1．6 SepA的功能及其致病机制

1．7 总结与展望

参考文献

实验研究

研究一 K88ac+产肠毒素大肠杆菌sepA基因缺失株的构建

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

参考文献

研究二 K88ac+产肠毒素大肠杆菌SepA相关功能探析

1、材料

2．方法

3．结果

4．讨论

参考文献

全文小结

致谢

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