水稻叶片形态相关基因DNL1和RL3(t)的定位和克隆

摘要

水稻叶片形态是理想株型的重要指标之一，与光合效率密切相关，进而影响水稻产量的最终形成。水稻是一个多型性作物，叶片的变异也极其多样。在一般的栽培品种中，水稻叶片通常为平展叶，少数品种的叶片为卷叶、窄叶等。迄今为止，尽管已经克隆了部分叶片发育相关基因，人们对控制叶片发育的分子机理认识得十分有限。因此，通过继续克隆更多的窄叶和卷叶基因，阐明叶片生长发育的分子机理，不仅具有很高的理论意义而且具有很大的实际利用价值。
　　本研究利用60Co-γ射线辐射籼稻品种93-11，获得了3份突变体:dnll、rl(t)-1和rl3(t)-2。其中，突变体dnl1表现为动态窄叶;突变体rl3(t)-1和rl3(t)-2表现为典型的卷叶。本研究对这3份突变体材料分别进行了突变体表型鉴定、遗传分析、基因定位以及图位克隆，并且对rl3(t)-1和rl3(t)-2突变体进行了等位性检测，对DNL1基因的功能进行了分析，主要研究结果如下:
　　一、动态窄叶基因DNL1的克隆和功能鉴定
　　1、本研究通过辐射获得一个水稻动态窄叶突变体(dynamic narrow leaf1，dnl1)。形态鉴定表明，与野生型品种93-11相比，突变体dnl1在播种后长出的叶片宽度正常，但是长出的第10叶会变得非常的窄，之后长出的叶片会逐渐变宽，但是仍然比93-11窄，直到第14叶宽度才会恢复正常。突变体dnl1的另一个显著特征是根毛的生长发育受阻，侧根数量也明显减少。此外，突变体dnl1的株高变矮，穗长变短，穗粒数减少，育性变低。突变体dnl1叶片边缘锯齿状刚毛的发育也受影响。
　　2、将dnl1突变体与93-11配制杂交，F1叶片宽度与野生型相似，F2中正常株和突变株的分离比符合3∶1，表明突变性状受单隐性基因控制。利用dnl1突变体与粳稻品种武运粳8号和武运粳7号杂交产生的F2、 F3群体，运用SSR、STS和CAPS标记，将DNL1基因定位在第1染色体PAC克隆AP002972和AP003768之间20kb的区段上。
　　3、通过基因预测发现，在DNL1基因所在的20kb内，仅有一个ORF，编码Aux/IAA响应蛋白(OsIAA6)。对该基因的测序结果表明，突变体dnl1在一个内含子中发生三个单碱基替换，一个外显子发生了单碱基替换，并且在启动子序列发生一个单碱基替换和两个碱基的插入。互补实验表明:在突变体dnl1背景下，导入了野生型基因OsIAA6的转基因植株，其叶片形态在整个生育期表现正常，根毛和侧根的生长发育也恢复正常。这些结果都说明，OsIAA6就是DNL1基因的候选基因。
　　4、荧光定量RT-PCR结果表明，DNL1/OsIAA6基因在所有的器官中都有表达，包括根、茎、叶片、叶鞘和幼穗。进一步的将DNL1基因启动子与GUS基因融合导入水稻植株中，该基因呈组成型表达特征，特别是在根和根毛中表达最为强烈。亚细胞定位分析表明，转DNL1/OsIAA6-G FP融合基因的植株原生质体中，仅在细胞核中能够观察到荧光，说明该蛋白是一个核定位蛋白。
　　5、大田实验和人工气候箱实验结果显示，dnl1突变体叶片形态受温度调控。当环境温度达到30℃左右时，dnl1突变体长出的叶片宽度显著变窄。进一步研究发现，窄叶的出现可能与DNL1/OsIAA6的表达量有关，该基因表达量较低时会出现窄叶。
　　6、用不同浓度的NAA处理93-11和dnl1，结果显示dnl1突变体对于外源生长素处理的敏感程度要比93-11低，而在低浓度NAA条件下，突变体dnl1的根毛缺失表型可以得到恢复。此外，重力实验表明，dnl1突变体的向重力性与野生型相比也受到了抑制。
　　7、通过RNA干涉下调候选基因DNL1/ OsIAA6的表达量，可导致动态窄叶的发生和根毛的伸长受到抑制，这些表型均与突变体dnl1表型相似。
　　8、已有研究表明，OsZHD1、ADL1、SRL1和NRL1基因与叶片的形态建成有关，OsZHD1的表达量升高会导致叶片卷曲，而ADL1、SRL1和NRL1基因的表达量降低会导致叶片卷曲、变窄。本研究中，ADL1、SRL1和NRL1基因在突变体dnl1中表达量均比在93-11中显著降低，而OSZHD1的表达量显著升高，说明当DNL1/OsIAA6表达降低后，会引起上述基因表达的变化，暗示了这些基因可能处于DNL1/OsIAA6基因的下游。与此类似，已有研究发现OsAPY基因与根毛的生长发育相关，当OsAPY基因表达下降时，根毛伸长受到明显抑制。在dnl1突变体中，OsAPY基因的表达量也明显下降，表明OsAPY基因也是处于DNL1/OsIAA6基因调控途径的下游。
　　二、卷叶基因RL3(t)的精细定位
　　1、形态分析表明，与野生型93-11相比，突变体rl3(t)-1和rl3(t)-2叶片显著内卷，株高降低，穗长变短，并且结实率降低。细胞学分析表明，突变体叶片中泡状细胞数量减少，泡状细胞的形态也发生了改变，推测突变体叶片卷曲可能是由于泡状细胞数量和形态改变所致。
　　2、以突变体rl3(t)-1和rl3(t)-2分别与93-11，和武运粳8号杂交，F1均表现为野生型性状，叶片无卷曲现象。在F2群体中发生了性状分离，其中，卷叶植株的数目明显偏少，正常植株与突变表型植株的比例偏离了孟德尔的理论分离比例(3∶1)。将两个突变体rl3(t)-1和rl3(t)-2相互杂交，F1表现为卷叶。这说明控制这两个卷叶突变体表型的基因是等位的。
　　3、以卷叶突变体rl3(t)-1与武运粳8号杂交衍生的F2和F3分离群体作为定位群体，利用SSR标记和新发展的STS标记和CAPS标记，将RL3(t)基因定位于第3号染色体长臂上STS标记S3-36与CAPS标记SAL1之间约23kb长的区间内。
　　4、生物信息学分析表明，在23kb区间内有4个注释基因，其中存在1个编码含F-box结构域蛋白的基因、1个锌指蛋白基因、1个淀粉酶基因以及1个叶绿素还原酶基因。

目录

摘要

符号说明

第1章 文献综述

1．1 水稻叶的形态、结构和功能

1．1．1 水稻叶的形态

1．1．2 水稻叶片的结构

1．1．3 水稻叶的功能

1．2 水稻窄叶性状的研究进展

1．2．1 窄叶与理想株型的关系

1．2．2 水稻窄叶性状的分子机制研究进展

1．3 生长素响应基因Aux／IAA的研究进展

1．3．1 生长素在植物生长发育中的作用

1．3．2 生长素原初响应基因

1．3．3 Aux／IAA基因在植物中的研究进展

1．4 水稻卷叶性状的研究进展

1．4．1 卷叶与理想株型的关系

1．4．2 水稻卷叶性状的分子机制研究进展

1．5 本研究的选题和目标

第2章 水稻动态窄叶基因的定位与克隆

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株和载体

2．1．3 常用分子生物学试剂

2．1．4 培养基

2．2 实验方法

2．2．1 F2遗传分析群体和基因定位群体的构建

2．2．2 水稻DNA提取

2．2．3 初步定位

2．2．4 精细定位

2．2．5 PCR反应

2．2．6 琼脂糖凝胶中DNA片段的回收

2．2．7 质粒DNA的提取、酶切与连接

2．2．8 感受态细胞的制备及转化

2．2．9 互补载体的构建

2．2．10 根瘤农杆菌介导的水稻转化

2．2．11 形态分析

2．3 结果与分析

2．3．1 水稻动态窄叶突变体dnl1的形态特征

2．3．2 动态窄叶性状的遗传分析

2．3．3 DNL1基因的克隆

2．4 讨论

第3章 DNL1／OsIAA6基因的功能研究

3．1 实验材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 菌株和载体

3．1．3 常用分子生物学试剂

3．1．4 培养基

3．2 实验方法

3．2．1 水稻DNA提取

3．2．2 水稻总RNA的抽提

3．2．3 PCR／qRT-PCR反应

3．2．4 琼脂糖凝胶中DNA片段的回收

3．2．5 质粒DNA的提取、酶切与连接

3．2．6 感受态细胞的制备及转化

3．2．7 载体构建

3．2．8 GUS染色

3．2．9 原生质体转化及亚细胞定位

3．2．10 NAA处理

3．2．11 重力实验

3．3 结果与分析

3．3．1 基因的表达模式

3．3．2 DNL1／OsIAA6蛋白的亚细胞定位

3．3．3 温度与窄叶形成的关系

3．3．4 dnl1对生长素和重力的反应

3．3．5 DNL1／OsIAA6基因的RNAi分析

3．3．6 叶和根发育相关基因的表达分析

3．4 讨论

3．4．1 dnl1所属的突变类型

3．4．2 窄叶的形成与温度和表达量的关系

3．4．3 DNL1／OsIAA6基因与根毛形成的关系

3．4．4 叶和根发育相关基因与DNL1／OsIAA6基因的关系

第4章 水稻卷叶基因的精细定位

4．1 实验材料

4．1．1 水稻材料

4．1．2 常用分子生物学试剂

4．2 实验方法

4．2．1 突变体的表型分析

4．2．2 遗传分析和基因定位群体的构建

4．2．3 水稻DNA提取

4．2．4 分子标记分析与PCR反应

4．2．5 RL3(t)基因的定位

4．3 结果与分析

4．3．1 水稻卷叶突变体的形态特征

4．3．2 叶片形态的细胞学分析

4．3．3 rl3(t)突变体的遗传分析

4．3．4 RL3(t)基因的定位

4．4 讨论

参考文献

附录

致谢

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