MiR-20b在肝癌中表达的意义及调控HIF-1α、VEGF对肝癌细胞(HepG2)增殖及凋亡的影响

摘要

目的：探究miR-20b在肝癌中表达水平与患者临床病理参数和预后的关系。明确miR-20b在HepG2细胞中的生物学功能，分析并验证其发挥作用的直接靶基因，探索其HepG2细胞增殖及凋亡的可能分子机制。
　　方法：1、收集76例肝癌组织标本并且选择76例正常肝脏组织作为对照，运用RT-PCR分别检测两组miR-20b的表达水平。
　　2、根据miR-20b在肝癌组织中的表达水平，将HCC患者分为miR-20b高表达组和低表达组，进而分析miR-20b表达量与HCC患者临床病理参数及预后之间的关系。
　　3、利用生物学数据库检索miR-20b可能的靶基因，并通过双荧光素酶报告系统、Westernblot等技术鉴定miR-20b对其靶基因的调控。
　　4、通过体外转染miR-20b mimic和inhibitor及siRNA-HIF-1α、siRNA-VEGF的方法，以MTT、流式细胞凋亡等检测miR-20b对HepG2细胞增殖与凋亡的影响。
　　结果：1、分别检测了76例肝癌组织及正常肝脏组织中miR-20b的表达水平，发现在大部分肝癌组织中miR-20b表达水平明显增高，差异有显著性。
　　2、MiR-20b表达水平与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分级无关，但与肿瘤转移(P=0.00)、TNM分期(P=0.00)及肿瘤复发(P=0.023)密切相关，miR-20b的高表达与肝癌患者的短总体生存期相关，提示miR-20b可以作为一个判断肝癌患者预后的独立预测因子。
　　3、构建HIF-1α、VEGF3'-UTR pGL3cm野生型及突变型荧光素酶报告载体和pCDH-miR-20b质粒共转染HepG2细胞后。结果显示，miR-20bb可以显著下调含有HIF-1α、VEGF靶基因3'-UTR的荧光素酶报告基因pGL3-3'-UTR的活性，而对含突变位点的表达质粒对荧光素酶活性无明显改变。表明miR-20b对HIF-1α、VEGF3'-UTR有直接负转录调控作用。
　　4、MiR-20b与HIF-1α、VEGF在HepG2细胞正常或模拟低氧条件表达水平呈现相反趋势。在常氧条件下，miR-20b的表达与低氧组（低氧组细胞使用300μmol/L CoCl2处理细胞24h）相比明显增高，具有统计学意义。低氧条件下VEGF的mRNA表达水平与常氧组相比明显增高，差异具有统计学意义。HIF-1α的mRNA表达水平增加并不明显。
　　5、MiR-20b的高表达能够明显增加HepG2细胞的增殖能力。当抑制miR-20b细胞增殖能力下降。同时沉默HIF-1α、VEGF功能后细胞增殖能力随之增强。HIF-1α、VEGF在常氧环境中对于细胞增殖起着决定性作用。
　　6、在常氧环境下细胞抑制miR-20b能够明显的降低细胞凋亡比率。同时沉默HIF-1α、VEGF功能后细胞凋亡比率明显增加。低氧环境下细胞转染miR-20b-mimics后发现细胞凋亡明显增加，HIF-1α、VEGF的表达对减少细胞凋亡起着决定性作用。
　　结论：1、与正常肝脏组织相比miR-20b在人肝癌组织中高表达，提示miR-20b的高表达与肝癌的发展、转移及复发具有密切相关。
　　2、肝癌组织中miR-20b的表达水平与肝癌患者的临床病理参数及总体生存期相关，暗示miR-20b的表达量可以作为判断肝癌患者预后的一个潜在的预测指标。
　　3、HIF-1α、VEGF为miR-20b直接靶基因，miR-20b对HIF-1α、VEGF3'-UTR有直接负转录调控作用。
　　4、正常环境中miR-20b高表达而调控HIF-1α、VEGF的表达;当细胞处于低氧环境下由于HIF-1α、VEGF的高表达反过来调控miR-20b的表达。
　　5、miR-20b和HIF-1α、VEGF在不同环境中相互调控影响细胞的增殖及细胞抗凋亡的能力。

目录

摘要

符号说明

前言

第一部分 MiR-20b在肝癌中表达的病理学意义

材料与方法

结果

第二部分 MiR-20b调控HIF-Iα、VEGF对肝癌细胞HepG2生物学行为的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 低氧诱导因子(HIF-1α)在肿瘤中的表达及其意义

致谢

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