甜瓜植株再生和根癌农杆菌介导的遗传转化的研究

摘要

甜瓜（Cucumis melo L.）是一种重要的蔬菜作物，营养丰富，瓜味甜美，原产热带，我国各地普遍栽培。转基因操作是开展过量表达、RNAi等基因功能研究的基础。为此，本试验以甜瓜子叶为材料，获得了稳定的甜瓜再生体系，并对其由根癌农杆菌介导的遗传转化进行了研究，主要结果如下:
　　1、甜瓜再生体系的建立:通过对种子发芽培养基、子叶诱芽培养基、苗龄、伸长培养基、生根培养基及驯化基质的研究，得出了甜瓜以子叶为外植体的最佳再生体系:去除种皮后置于1/2MS培养基中培养最适于种子发芽，最佳的芽诱导培养基为MS+1.0 mg/L6-苄基腺嘌呤(6-BA)，最适苗龄为4-5天，约28天后，再生芽转入最佳伸长培养基(MS+0.05mg/L6-BA+0.2 mg/L赤霉素(GA3))中培养，约14天后，将其转入最佳生根培养基(1/2MS+0.1 mg/L吲哚丁酸(IBA))中进行生根培养，约20天后，再生植株开始驯化，发现商品化基质（购于镇江兴农有机肥有限公司的蔬菜育苗基质）优于混合基质（草炭∶蛭石∶珍珠岩=2∶1∶1）。统计结果显示，整个再生过程需要62天左右。
　　2、甜瓜子叶转化体系的建立:将苗龄5天子叶在上述最佳诱芽培养基上预培养1天（或苗龄4天子叶预培养2天），以LBA4404（含质粒pCAMBIA2301）菌液侵染后黑暗条件下共培养3天，转入选择培养基(最佳诱芽培养基+100 mg/L卡那霉素(Kan)+500 mg/L头孢霉素(Cef))在16小时光周期、27℃条件下培养，25天左右将抗性芽转入伸长培养基(MS+0.05 mg/L6-BA+0.2 mg/LGA3+500 mg/L Cef)中培养。抗性芽2 cm左右时转入生根培养基(1/2MS+0.1 mg/L IBA++200 mg/L羧苄青霉素(Carb))，获得抗性株系。
　　结果显示，以子叶为外植体，从选择培养开始到转化苗生根需要60天左右。若以RT-PCR阳性作为判断最终转化成功的标准，子叶转化体系的转化率为0.62％。

目录

摘要

引言

缩略词表

第一章 文献综述

1 甜瓜组织培养再生体系的研究进展

1．1 内在影响因素

1．2 外部影响因素

2 甜瓜再生体系研究中的问题及展望

3 农杆菌介导的转化体系研究进展

3．1 转化方法

3．2 转化机理

3．3 转化过程中的影响因素

4 甜瓜遗传转化研究中存在问题及展望

第二章 甜瓜再生体系的研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

1．3 试验处理

2 结果与分析

2．1 不同处理对种子发芽情况的影响

2．2 不同处理对外植体不定芽诱导的影响

2．3 不同苗龄对子叶再生芽诱导的影响

2．4 不同浓度6-BA及GA3对芽伸长的影响

2．5 不同浓度的MS、IAA和IBA对再生苗生根的影响

2．6 不同驯化基质对再生苗成活率的影响

3 讨论

第三章 甜瓜遗传转化的研究

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2 试验处理

2．1 Kan对子叶选择压的筛选

2．2 Carb、Cef对子叶敏感性测验

2．3 Carb、Cef对根敏感性测验

2．4 不同处理对转化的影响

3 结果分析

3．1 子叶对Kan的敏感性测验

3．2 子叶对Carb和Cef的敏感性测验

3．3 根对Carb和Cef的敏感性测验

3．4 不同处理芽诱导情况

3．5 转基因植株的检测

4 讨论

全文结论

参考文献

致谢

声明