H5亚型禽流感病毒HA与NA基因的适配性研究

摘要

H5亚型高致病性禽流感(Avian influenza，AI)是重要的人兽共患病，是世界动物卫生组织规定的法定通报传染病之一，在多个国家流行。它不仅给养禽业带来了巨大的经济损失，同时也严重威胁着人类的健康。为了适应宿主与环境的变化，禽流感病毒(Avianinfluenza virus，AIV)以极快的速度发生着变异，其中的一些优势变异株会在不断进化的过程中存活下来。通过对AIV的监测发现，近年来，Clade2.3.4已成为我国大部分地区的主要流行分支之一，并且其次分支中出现了大量不同亚型的重组病毒。因此，我们选取Clade2.3.4和Clade2.3.4.4中2种不同的HA(SY、JY株)，分别与3种不同亚型NA(NA1、NA2、NA8)组合，构建出一系列重组病毒，通过比较其生物学特性和致病性的差异，来评价Clade2.3.4中禽流感病毒HA与NA基因的适配性。
　　1禽流感病毒的筛选纯化及不周HA和NA组合重组病毒的构建
　　先通过序列比对以及特殊位点分析筛选出母本毒株SY(A/mallard/Huadong/S/2005，H5N1)和JY(A/duck/Eastern China/2014，H5N8)，AIVSY株属于Clade2.3.4; AIVJY株属于Clade2.3.4.4。分析其HA连接肽序列发现SY株为PLRERRR-KR↓G，与Re-5疫苗株一致，而JY株则为PLREKRR-KR↓G，有一个位点的突变，并且JY株HA蛋白上170位糖基化位点是缺失的。试验采用Hoffmann8质粒拯救系统，以SY株内部基因为骨架，将SY与JY的HA分别与1个NA1、2个NA2和2个NA8组合，利用反向遗传技术构建出HA与NA组合的10株重组病毒，分别命名为SY、SY-ZJ、SY-CZ、SY-JYD、SY-JY、JY-SY、JY-ZJ、JY-CZ、JY-JYD和JY。测序证明病毒基因序列的正确性，传代结果显示重组病毒滴度稳定，因此成功拯救了预期的重组病毒。
　　2不同HA和NA组合重组病毒的生物学特性及致病性研究
　　10株重组病毒的EID50、TCID50和MDT值均相似。含SYHA的所有重组病毒，均只有α2，3唾液酸受体结合特性，与母本病毒一致。含JYHA的重组病毒中，只有JY-SY、JY表现出α2，3和α，6唾液酸双受体结合特性。神经氨酸酶活性测定显示NA1和NA8的活性显著高于NA2。间接免疫荧光试验检测病毒感染后NP、HA蛋白的表达情况，结果显示所有重组病毒的这两种蛋白表达时序类似。激光共聚焦荧光显微镜观察所有重组病毒NP蛋白在细胞核和细胞浆的表达也类似。但流式细胞检测NP、HA、M三种蛋白表达时显示，病毒含SYHA时，H5N1亚型病毒蛋白表达量多，病毒含JYHA时，H5N2亚型病毒的蛋白表达量多，而H5N8亚型病毒的蛋白表达量则相对低。鸡的致病性试验显示，含SYHA病毒的毒力要高于含JYHA病毒，且在所有含有SYHA的病毒中，各毒株的毒力没有明显差异。但换成JYHA时，H5N2和H5N8亚型病毒的毒力要高于H5N1亚型病毒毒力。各重组病毒对小鼠致病性试验结果也表明，含SYHA病毒的毒力要高于含JYHA病毒。
　　综上所述，禽流感病毒的HA和NA基因具有适配性，这种特性影响病毒的复制、传播和致病力。含Clade2.3.4.4 HA的H5N2和H5N8亚型病毒对鸡的致病力增加有利于病毒的感染和传播，对病毒的流行起着重要作用。

目录

摘要

符号说明

综述

1 流感病毒的致病性

2 H5亚型AIV的基因进化

3 糖基化修饰对H5亚型AIV的影响

参考文献

第一章 H5亚型流感毒株的筛选纯化及重组病毒的构建

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二章 重组病毒生物学特性及致病性测定

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文小结

致谢

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